Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II
Chapters
Summary June 16th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Proteomisk profilering af tyrosin-nitrerede proteiner har været en udfordrende teknik på grund af den lave overflod af 3-nitrotyrosin modifikation. Her beskriver vi en ny metode til tilsætning af nitropeptid og profilering ved hjælp af angiotensin II som model. Denne metode kan udvides til andre in vitro -eller in vivo -systemer.
Transcript
Dette budskab, der kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om, hvordan man beriger og identificerer nitropeptider ved en kemisk tilgang og massespektrometrien. Denne teknik har en forbedret følsomhed for påvisning af nitropeptider ved massespektrometri, og som kan anvendes på både in vitro biokemiske systemer og endogene biologiske væv. Ved nitro-angiotensin II-afsaltning anvendes en 1 milliliterrør for at forkonditionere en sekstraktion i omvendt fase eller SPE-søjle med tilsætning af 500 mikroliter methanol og 500 mikroliter vand i toppen af kolonnen.
Når alt vandet er løbet gennem kolonnen, skal der indlæsses 410 mikroliter nitro-angiotensin II-opløsning på kolonnen. Kolonnen vaskes med 500 mikroliter på 5 % methanol og vand og 300 mikroliter på 80 % methanol og vand for at fremkalde nitropeptidet. Tør derefter eluatet ved hastighedsvakuum i standardindstillingen ved stuetemperatur.
For primær alkylation af alkylation rekonstitueres den pulveriserede nitro-angiotensin II i 100 mikroliter på 100 millimolar Triethylammonium bikarbonatopløsning og tilsættes 400 mikroliter på 4% formaldehyd til opløsningen i en røghætte med kort blanding. Dernæst tilsættes fire mikroliter på 0,6 molar natrium cyanoborohydrid til opløsningen med omrystning ved 400 rotationer i minuttet i en time ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning slukkes mærkningsreaktionen med 16 mikroliter 1%ammoniakopløsning i fem minutter ved stuetemperatur efterfulgt af forsuring med otte mikroliter myresyre.
Derefter afsalt opløsningen i en ny omvendt fase SPE kolonne som netop påvist. For nitrotyrosin til aminotyrosin reduktion, rekonstituere dimethyl-mærket nitro-angiotensin II i 500 mikroliter af PBS og tilsæt 10 mikroliter af en molar natrium dithionat for en times inkubation ved stuetemperatur. Efter reduktionsreaktionen bliver den gule opløsning tydelig.
Afsalt den reducerede prøve i en ny SPE-kolonne i omvendt fase som påvist. Til biotinylering og tilsætning rekonstitueres den dimethylemærkede aminoangiotensin II i 500 mikroliter PBS efterfulgt af tilsætning af fem mikroliter af 40 nanomolar NHS-S-S biotin opløst i dimethylsulfoxid i to timers inkubation ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning slukkes reaktionen med en mikroliter på 5 %hydroxylamin, og der tilsættes 500 mikroliter frisk PBS til 100 mikroliter Streptavidin Agaroseper til ækvilibrering med tre separate centrifugeringer.
Efter den sidste centrifugering tilsættes 100 mikroliter perler til reaktionssystemet i en times inkubation på en Rotary Shaker ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning vaskes systemet fire gange med 500 mikroliter frisk PBS pr. vask efterfulgt af tilsætning af 400 mikroliter på 10 millimolar dithiothreitol i en 45 minutters inkubation ved 50 grader Celsius. I slutningen af inkubationen drejes kolonnen ned og supernatanten overføres til et nyt rør med 20 mikroliter på 0,5 molar iodoacetamid for en 20 minutters inkubation i mørke.
Derefter afsalt opløsningen i en ny omvendt fase SPE kolonne som påvist og løse det tørre peptid i 20 mikroliter af 0,1% myresyre. Til detektion skal produktet indlæses på en flydende kromatograf med et tandemmassespektrometer. De modificerede angiotensin II-peptider adskilles med en 60 minutters gradientalusion med en strømningshastighed på 0,3 mikroliter pr. minut med det nanohøjt tryk flydende kromatografisystem, der er direkte forbundet med massespektrometeret med høj opløsning.
I den dataafhængige anskaffelsestilstand skal du indstille et enkelt fuldscanningsmassespektrum i massespektrometeret efterfulgt af 20 dataafhængige tandemmassespektrometerscanninger ved 28 % normaliseret kollisionsenergi. Åbn derefter massespektredataene, og identificer produktets toppe i hvert trin for at bekræfte, at den kemiske reaktion er blevet udført med succes. Her kan repræsentative massespektre af angiotensin II før og efter hver kemisk modifikation som påvist observeres.
Forbindelsens molekylvægt angives ved masse-til-lade-forholdet værdier af mono isotoptoppen, hvilket indikerer, at den kemiske modifikation på angiotensin II med succes blev opnået for dette trin. Her vises det endelige produkt, som detekterede og karakteriseret ved flydende kromatografi med tandemmassespektrometri. Kvantitativ analyse af nitropeptider ved dimethylmærkning gør det muligt at beregne de relative mængder let og tung ved at sammenligne intensiteten af monoisotoptoppen i hver gruppe, hvilket gør det muligt at kvantificere de berigede nitropeptider fra forskellige grupper.
Efter proceduren, kan du bruge et program søgemaskine såsom SEQUEST max antal pFIND at identificere de potentielle nitropeptider. Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for påbegyndelsen af de biologiske funktioner i specifikke nitrationssteder.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
