Login processing...

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biochemistry

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Journal (Biochemistry)

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Journal (Biochemistry)

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Click here for the English version

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Article DOI: 10.3791/59391-v

June 16th, 2019 •

Shan Feng^1,2, Xiaofei Wen³, Xin Lu^2,4,5,6

¹Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, ²Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, ³Department of Urology, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, ⁴Boler-Parseghian Center for Rare and Neglected Diseases, University of Notre Dame, ⁵Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame, ⁶Tumor Microenvironment and Metastasis Program, Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

June 16th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Proteomikk profilering av tyrosin-Nitro proteiner har vært en utfordrende teknikk på grunn av den lave overflod av 3-nitrotyrosine modifikasjon. Her beskriver vi en ny tilnærming for nitropeptide berikelse og profilering ved å bruke angiotensin II som modell. Denne metoden kan utvides for andre in vitro -eller in vivo -systemer.

Transcript

Dette budskapet som kan bidra til å svare på viktige spørsmål om hvordan å berike og identifisere nitropeptider ved en kjemisk tilnærming og massespektrometri. Denne teknikken har en forbedret følsomhet for å oppdage nitropeptider ved massespektrometri, og som kan brukes på både in vitro biokjemiske systemer og endogene biologiske vev. For nitro-angiotensin II desalting, bruk en en milliliter pipet for å precondition en omvendt fase solid-fase ekstraksjon eller SPE kolonne med tillegg av 500 mikroliter metanol og 500 mikroliter vann i toppen av kolonnen.

Når alt vannet har gått gjennom kolonnen, last 410 mikroliter nitro-angiotensin II-løsning på kolonnen. Vask kolonnen med 500 mikroliter på 5% metanol og vann og 300 mikroliter på 80% metanol og vann for å elute nitropeptid. Tørk deretter eluatet etter hastighetsvakuum i standardinnstillingen ved romtemperatur.

For primær aminalkylering må den pulveriserte nitro-angiotensin II i 100 mikroliter på 100 millimolar Triethylammonium bikarbonatoppløsning og tilsett 400 mikroliter med 4% formaldehyd til løsningen i en røykhette med kort blanding. Deretter legger du til fire mikroliter på 0,6 molar natrium cyanoborohydride til løsningen med risting ved 400 rotasjoner per minutt i en time ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen slukker du merkereaksjonen med 16 mikroliter med 1% ammoniakkoppløsning i fem minutter ved romtemperatur etterfulgt av forsuring med åtte mikroliter maursyre.

Deretter avsalte løsningen i en ny omvendt fase SPE kolonne som nettopp demonstrert. For nitrotyrosin til aminotyrosinreduksjon, rekonstituer dimetylmerket nitro-angiotensin II i 500 mikroliter PBS og tilsett 10 mikroliter av en molarnatriumditionat i en time inkubasjon ved romtemperatur. Etter reduksjonsreaksjonen vil den gule løsningen bli klar.

Desalt den reduserte prøven i en ny omvendt fase SPE kolonne som demonstrert. For biotinylering og berikelse, rekonstituer dimetyl-merket aminoangiotensin II i 500 mikroliter PBS etterfulgt av tillegg av fem mikroliter på 40 nanomolar NHS-S-S biotin oppløst i dimetylsulfoksid i en to timers inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, slukke reaksjonen med en mikroliter på 5% hydroksylamin og tilsett 500 mikroliter av friske PBS til 100 mikroliter streptavidin Agarose perler for likevekt av tre separate sentrifugasjoner.

Etter den siste sentrifugeringen, legg til 100 mikroliter perler til reaksjonssystemet i en time inkubasjon på en Rotary Shaker ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, vask systemet fire ganger med 500 mikroliter frisk PBS per vask etterfulgt av tillegg av 400 mikroliter på 10 millimolar dithiothreitol for en 45 minutters inkubasjon ved 50 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, spinn ned kolonnen og overfør supernatanten til et nytt rør som inneholder 20 mikroliter på 0,5 molar iodoacetamid i en 20 minutters inkubasjon i mørket.

Deretter avsalte løsningen i en ny spe-kolonne i omvendt fase som demonstrert og løse det tørre peptidet i 20 mikroliter på 0,1 % maursyre. For deteksjon, last produktet på en flytende kromatograf med et tandemmassespektrometer. Skill de modifiserte angiotensin II peptidene med en 60 minutters gradient elusion med en strømningshastighet på 0,3 mikroliter per minutt med nanohøytrykksvæskekromatografisystemet som er direkte grensesnitt med høyoppløsningsmassespektrometeret.

I den dataavhengige anskaffelsesmodusen angir du ett enkelt massespektrum for full skanning i massespektrometeret, etterfulgt av 20 dataavhengige tandemmassespektrometerskanninger ved 28 % normalisert kollisjonsenergi. Åpne deretter massespektradataene og identifiser toppene av produktet i hvert trinn for å bekrefte at den kjemiske reaksjonen er utført. Her kan representativ massespektra av angiotensin II før og etter hver kjemiske modifikasjon som demonstrert observeres.

Den molekylære vekten av forbindelsen indikeres av masse-til-lade-forholdsverdiene til monoisotoptoppen, noe som indikerer at den kjemiske modifikasjonen på angiotensin II ble oppnådd for dette trinnet. Her vises det endelige produktet som oppdaget og preget av flytende kromatografi med tandemmassespektrometri. Kvantitativ analyse av nitropeptider ved dimetylmerking gjør det mulig å beregning av de relative mengdene lett og tung ved sammenligning av intensiteten til monoisotoptoppen i hver gruppe, slik at kvantifisering av de berikede nitropeptider fra forskjellige grupper.

Etter fremgangsmåten kan du bruke en programsøkemotor, for eksempel SEQUEST maks antall pFIND for å identifisere potensielle nitropeptider. Etter utviklingen banet denne teknikken veien for starten av de biologiske funksjonene til spesifikke nitrasjonssteder.

X

Simple Hit Counter