Biochemistry
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Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II
Chapters
Summary June 16th, 2019
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O perfilamento Proteomic de proteínas tyrosine-nitrated foi uma técnica desafiante devido à baixa abundância da modificação da 3-nitrotyrosine. Aqui nós descrevemos uma aproximação nova para o enriquecimento e o perfilamento do nitropeptide usando a angiotensina II como o modelo. Este método pode ser estendido para outros sistemas in vitro ou in vivo .
Transcript
Esta mensagem que pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como enriquecer e identificar nitropeptídeos por uma abordagem química e a espectrometria de massa. Esta técnica tem uma sensibilidade aprimorada para detectar nitropeptídeos por espectrometria de massa e que pode ser aplicada tanto a sistemas bioquímicos in vitro quanto a tecidos biológicos endógenos. Para desalar nitro-angiotensin II, use um pipet de um mililitro para pré-condição de extração em fase sólida de fase inversa ou coluna SPE com a adição de 500 microliters de metanol e 500 microliters de água no topo da coluna.
Quando toda a água passar pela coluna, carregue 410 microliters de solução nitro-angiotensina II na coluna. Lave a coluna com 500 microlitadores de 5%de metanol e água e 300 microliters de 80% de metanol e água para elutar o nitropeptídeo. Em seguida, seque o elunato por vácuo de velocidade na configuração padrão à temperatura ambiente.
Para a amitomina primária, reconstitua o nitro-angiotensin II em pó em 100 microliters de 100 milimosinas solução de bicarbonato de trietilamônio e adicione 400 microliters de 4% de formaldeído à solução em um capô de fumaça com breve mistura. Em seguida, adicione quatro microliters de 0,6 cianoboroidride de sódio molar à solução com agitação a 400 rotações por minuto durante uma hora em temperatura ambiente. Ao final da incubação, sacie a reação de rotulagem com 16 microliters de solução de 1%amônia por cinco minutos à temperatura ambiente, seguida pela acidificação com oito microliters de ácido fórmico.
Em seguida, desaltar a solução em uma nova coluna DE FASE INVERSA SPE como apenas demonstrado. Para a nitrotilrose para a redução da aminotyrosina, reconstitua a nitro-angiotensina i em 500 microlitros de PBS e adicione 10 microlitros de um dithionato de sódio molar para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. Após a reação de redução, a solução amarela ficará clara.
Desaltar a amostra reduzida em uma nova coluna DE SPE de fase inversa, como demonstrado. Para biotinylação e enriquecimento, reconstitua a aminoangiotensina i em 500 microlitrais de PBS seguida pela adição de cinco microlitadores de 40 biotinas nanomolar NHS-S-S dissolvidas em sulfóxido de dimetil para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente. No final da incubação, sacie a reação com um microliter de 5% de hidroxilamina e adicione 500 microliters de PBS fresco a 100 microliters de Contas Streptavidin Agarose para o equilíbrio por três centrífugas separadas.
Após a última centrifugação, adicione 100 microliters de contas ao sistema de reação para uma incubação de uma hora em um Shaker Rotativo à temperatura ambiente. No final da incubação, lave o sistema quatro vezes com 500 microliters de PBS fresco por lavagem seguido pela adição de 400 microliters de 10 milimolar dithiothreitol para uma incubação de 45 minutos a 50 graus Celsius. No final da incubação, gire a coluna e transfira o supernante para um novo tubo contendo 20 microliters de 0,5 iodoacetamida molar para uma incubação de 20 minutos no escuro.
Em seguida, deságua a solução em uma nova coluna SPE de fase inversa como demonstrado e resolver o peptídeo seco em 20 microliters de ácido fórmico de 0,1%. Para detecção, carregue o produto em um cromatógrafo líquido com um espectrômetro de massa tandem. Separe os peptídeos de angiotensina II modificados por uma elusão gradiente de 60 minutos a uma taxa de fluxo de 0,3 microliters por minuto com o sistema de cromatografia líquida de nano-alta pressão que é diretamente interfaceado com o espectrômetro de massa de alta resolução.
No modo de aquisição dependente de dados, defina um único espectro de massa de varredura total no espectrômetro de massa, seguido por 20 varreduras de espectrômetro de massa tandem dependentes de dados a 28% de energia de colisão normalizada. Em seguida, abra os dados de espectro de massa e identifique os picos do produto em cada etapa para confirmar que a reação química foi realizada com sucesso. Aqui, podem ser observados espectros de massa representativos de angiotensina II antes e depois de cada modificação química como demonstrado.
O peso molecular do composto é indicado pelos valores da razão massa-carga do pico do mono isótopo, indicando que a modificação química na angiotensina II foi alcançada com sucesso para essa etapa. Aqui, mostra-se o produto final detectado e caracterizado pela cromatografia líquida com espectrometria de massa tandem. A análise quantitativa dos nitropeptídeos por rotulagem de dimetila permite o cálculo das quantidades relativas de leve e pesado através da comparação da intensidade do pico de monoistoposo em cada grupo, permitindo a quantificação dos nitropeptídeos enriquecidos de diferentes grupos.
Após o procedimento, você pode usar um mecanismo de busca de programa, como a contagem máxima de pFIND de SEQUEST para identificar os potenciais nitropeptídeos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o início das funções biológicas de sítios específicos de nitração.
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