Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II
Chapters
Summary June 16th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Протеомное профилирование тирозиновых белков было сложной техникой из-за низкого обилия 3-нитротирозиновой модификации. Здесь мы описываем новый подход к обогащению нитропептида и профилированию с помощью Angiotensin II в качестве модели. Этот метод может быть расширен для других систем in vitro или in vivo.
Transcript
Это сообщение, которое может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как обогатить и определить нитропептиды с помощью химического подхода и масс-спектрометрии. Этот метод имеет повышенную чувствительность для обнаружения нитропептидов с помощью масс-спектрометрии и который может быть применен как к биохимическим системам in vitro, так и к эндогенным биологическим тканям. Для десалирования нитро-ангиотензина II используйте одноми миллилитрную трубу для предварительного извлечения твердой фазы обратной фазы или столбца SPE с добавлением 500 микролитров метанола и 500 микролитров воды в верхнюю часть колонны.
Когда вся вода проехает через колонну, загрузите на колонну 410 микролитров раствора нитроангиотензина II. Вымойте колонку с 500 микролитров 5%метанола и воды и 300 микролитров 80% метанола и воды, чтобы утоить нитропептида. Затем высушите элуат по скорости вакуума в настройке по умолчанию при комнатной температуре.
Для первичной алкиляции амина, восстановить порошкообразный нитро-ангиотензин II в 100 микролитров 100 миллимолярный триэтиламмоний бикарбонатный раствор и добавить 400 микролитров 4%формальдегида к раствору в дым капот с кратким смешивания. Затем добавьте четыре микролитера 0,6 молярного цыаноборогидрида к раствору при встряхивании при 400 вращениях в минуту в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации утоляют реакцию маркировки 16 микролитров 1%аммиачного раствора в течение пяти минут при комнатной температуре с последующим подкислением с восемью микролитерами кремной кислоты.
Затем опреснюете решение в новой колонке SPE обратной фазы, как это было продемонстрировано. Для сокращения нитротирозина до аминотирозина, воссоздайте диметил-маркированную нитроангиотензин II в 500 микролитров PBS и добавьте 10 микролитров одного дитионата натрия в течение одного часа инкубации при комнатной температуре. После снижения реакции, желтый раствор станет ясно.
Опустить уменьшенную выборку в новой колонке SPE обратной фазы, как это было продемонстрировано. Для биотинилирования и обогащения, восстановить диметил-маркированных аминоангиотензина II в 500 микролитров PBS следуют добавление пяти микролитров 40 наномолярных NHS-S-S биотин растворяется в диметил сульфоксид в течение двух часов инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации, утолить реакцию с одним микролитером 5%гидроксиламина и добавить 500 микролитров свежего PBS до 100 микролитров Streptavidin Agarose бусы для эквилибрации тремя отдельными центрифугами.
После последней центрифугации добавьте 100 микролитров бисера в систему реакции в течение одного часа инкубации на Ротари Шейкер при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть систему четыре раза с 500 микролитров свежего PBS за стирку с последующим добавлением 400 микролитров 10 миллимолярный дитиотрейтол в течение 45 минут инкубации при 50 градусов по Цельсию. В конце инкубации, спина вниз по колонке и передачи супернатанта в новую трубку, содержащую 20 микролитров 0,5 молярного иодоацетамида в течение 20 минут инкубации в темноте.
Затем опреснють раствор в новой обратной фазе SPE колонки, как попродемонстрировано и решить сухой пептид в 20 микролитров 0,1% formic кислоты. Для обнаружения загрузите продукт на жидкий хроматограф с тандемным масс-спектрометром. Разделите модифицированные пептиды ангиотензина II на 60-минутный градиентный элюзион со скоростью потока 0,3 микролитера в минуту с системой жидкой хроматографии высокого давления, которая непосредственно взаимодействует с масс-спектрометром высокого разрешения.
В режиме получения данных, зависящих от данных, установите единый полный спектр массы сканирования в масс-спектрометре, а затем 20 зависящих от данных тандемных масс-спектрометров сканируют на 28% нормализованной энергии столкновения. Затем откройте данные о массовых спектрах и определите пики продукта на каждом шагу, чтобы подтвердить, что химическая реакция была успешно выполнена. Здесь можно наблюдать репрезентативные массовые спектры ангиотензина II до и после каждой химической модификации, как это было продемонстрировано.
Молекулярный вес соединения указывается значениями соотношения массы к заряду моноизотопного пика, что указывает на то, что химическая модификация ангиотензина II была успешно достигнута для этого шага. Здесь показан конечный продукт, который обнаруживается и характеризуется жидкой хроматографией с тандемной масс-спектрометрией. Количественный анализ нитропептидов с помощью диметил-маркировки позволяет вычислить относительное количество света и тяжелых путем сравнения интенсивности моноизотопного пика в каждой группе, что позволяет количественно оценить обогащенные нитопептиды из разных групп.
Следуя процедуре, вы можете использовать поисковую систему программы, такую как максимальный отсчет ФСИН, чтобы определить потенциальные нитропептиды. После своего развития, эта техника проложила путь для начала биологических функций конкретных нитратных участков.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
