وقد عكس المنتسخة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) معيار الذهب كوانتيتاتيون مرناً. وتستخدم حاليا فحوصات اثنين والرقمية بكر (دبكر)1 والوقت الحقيقي، والكمية بكر (qPCR)2 . تقنيات PCR اثنين، قد دبكر حساسية أكبر من قبكر مما يوحي بأنه يمكن استخدامه لقياس وفرة مرناً في الخلايا المفردة. ومع ذلك، أنتج تحليل دبكر مرناس وفرة منخفضة في برك من 5 إلى 10 بويضات كل كل عينة تجريبية في أيدينا، البيانات مع إمكانية تكرار نتائج منخفضة وعالية التباين3. ومن المرجح نتيجة لخطأ التجريبية المرتبطة باستخراج الحمض النووي الريبي وكفاءة النسخ العكسي. تسلسل الحمض النووي الريبي قد أجريت باستخدام ماوس واحدة وبويضات بشرية4،5. ويتطلب هذا الأسلوب كدنا التضخيم الخطوات المطلوبة لتوليد المكتبة مما يزيد من احتمال تقلب داخل مجموعة تجريبية. وعلاوة على ذلك، قد لا تكون النصوص وفرة منخفضة قابلة للاكتشاف. على الرغم من أن تسلسل الأسعار تراجعت في السنوات القليلة الماضية، لا يزال يمكن أن يكون تكلفة باهظة بسبب التكلفة العالية للتحليلات المعلوماتية. وأخيراً، مرناً الترجمة عملية دينامية مع التغيرات المكانية المساهمة في وظيفة البروتين6. ولذلك، نحن المبينة على اعتماد أسلوب التي ستنتج التدابير الكمية الدقيقة واستنساخه وتوطين مرناس الفردية في بويضات واحد.
تشعبت الحمض النووي بالإضافة إلى الأسفار في التهجين الموقعي تضخيم الإشارات fluorescence بدلاً من زيادة الحمض النووي الريبي/كدنا تمكين الكشف عن مرناس واحدة في الخلايا الفردية 7،،من89. الفحص يتم من خلال سلسلة من التهجين والتضخيم (باستخدام الحمض النووي تشعبت) والأسفار وسم خطوات من أجل تضخيم الإشارات fluorescence7. ويبدأ التقنية ملزمة أزواج مسبار اليغنوكليوتيد 18-25 قاعدة مكملة لمحددة مرناً3،،من810. أزواج التحقيق خمسة عشر إلى عشرين مصممة لخصوصية ضمان كل نسخة لنص الهدف. ويعقب التهجين مرناً على حدة تحقيقات ما قبل مكبر للصوت ومكبر للصوت التي تشكل تكويناً متفرع. تقريبا، ربط 400 التسمية fluorophores كل مكبر للصوت، أدى إلى زيادة 8000-fold في الأسفار يتيح الكشف عن مرناس الفردية (الشكل 1)11.
رقم 1: التخطيطي البروتوكول SM-الأسماك- التهجين متسلسلة من محاضر جلسات التحقيق المحددة، تشعبت الحمض النووي مكبر للصوت وفلوروفوري إلى هدف يرد مرناً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
خلية الدراسات السابقة باستخدام جزيء واحد الأسفار في الموقع مرناس β-أكتين التهجين (SM-الأسماك) المترجمة في الخلايا العصبية الفردية12 وفيروس الورم الحليمي البشري الحمض النووي في سرطان عنق الرحم خطوط7. برامج الكمبيوتر "العثور على الفور" و "تتبع البرنامج" يحدد إشارة الفلورسنت الشروريه الفردية وقد استخدمت بنجاح لتقدير عدد مرناس في كل خلية3،13.
استناداً إلى نتائج الكشف مرناً في الخلايا العصبية12، افترضنا أن SM-الأسماك من شأنه أن يثبت أداة مفيدة كوانتيتاتي مستويات نسخة في بويضات مورين والأجنة بما في ذلك مرناس وفرة منخفضة. ومع ذلك، الأسلوب هو الأمثل للاستخدام مع خلايا ثابتة ملتصقة وفورمالدهايد ثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ أقسام الأنسجة (فب). لا يمكن أن تلتزم بويضات شريحة، حتى عندما كانوا المغلفة مع بولي-L-يسين. وعلاوة على ذلك، فأكثر هشاشة من خلايا جسدية وأقسام الأنسجة الناتجة في تحلل الخلية عند التعرض لبعض المخازن المؤقتة الملكية في مجموعات المتاحة تجارياً3. للتغلب على هذه التحديات، بويضات كانت ثابتة ونقلها يدوياً بين قطرات من المخازن المؤقتة. وعلاوة على ذلك، استعيض عن مخازن بيرميبيليزيشن، والمياه والصرف الصحي في المجموعات لتقليل تحلل الخلية. المسابر المصممة مسبقاً يتم شراؤها جنبا إلى جنب مع مجموعة الأسماك أو يمكن أن يطلب إلى وقائع محددة. يتوفر كل مجموعة التحقيق الملكية في واحدة من ثلاث قنوات الفلورية (C1 و C2 و C3) للسماح بالإرسال المتعدد. في التجربة الحالية، كانت بويضات موريني المزدوج الملون وكمياً باستخدام مجس C2 نانوج وتحقيق C3 Pou5f1 . واختيرت هذه المسابر استناداً إلى التعبير عنها نانج و Pou5f1 في بويضات والأجنة. في ختام خطوات التهجين، وضعت بويضات في قطرات من تصاعد تتلاشى المضادة وسائل الإعلام لتطبيقها على الشرائح النسيجي. واستخدمت الصور [كنفوكل] للتحديد الكمي لعدد الإشارات الفلورسنت الشروريه التي تمثل مرناس الفردية. بالإضافة إلى تحديد كمية مرناس، كما أظهر تصوير التوزيع المكاني مرناً محددة في الخلية، يتم فيها أساليب القياس الكمي الحمض النووي الريبي أخرى غير قادر على تحقيق. وتبين هذه التقنية قد تقلب منخفض داخل مجموعة تجريبية تسمح باستخدام عدد أقل من بويضات في كل مجموعة تجريبية لتحديد وجود اختلافات كبيرة بين المجموعات التجريبية3.
هذه التقنية لا تسمح فقط توطين، ولكن أيضا كمية من mRNAs المرشح في البويضات الفردية والأجنة. مقارنة مع المقايسات الأخرى، بما في ذلك PCR، والانتهاء من نتائج تقنية في بيانات استنساخ مع اختلاف منخفض. إثبات الإجراء سيكون (كيلسي تيمي) طالبة دراسات عليا في مختبري
ابدأ هذا الإجراء بإعداد المادة المطلوبة وفئران الإناث في عمر خمسة إلى ثمانية أسابيع كما هو موضح في بروتوكول النص. تنظيف الماوس باستخدام 70٪ الإيثانول. كشف تجويف البطن وتصور الجهاز التناسلي للأنثى.
أمسك المبيض مع ملقط وإزالة أربطة الرحم والأنسجة الدهنية الزائدة من جميع أنحاء المبيض. قطع oviduct من الرحم. ثم، ضع زوج أوفيدوج المبيض في عقد دافئ المتوسطة في طبق 35 ملليمتر.
إزالة المبيض وأي الأنسجة الدهنية المحيطة. المسيل للدموع ampullae منتفخة من oviduct باستخدام نصف بوصة 27 قياس إبرة. دفع oviduct في موقع المسيل للدموع وسيتم طرد مجمعات البويض خلية cumulus.
باستخدام ماصة الفم لنقل البويضات المبيضة إلى قطرة 100 ميكرولتر التي تحتوي على عقد المتوسطة مع الهيالورونيداز. لطرد خلايا الركام، الماصات ميتافاسيس اثنين من مجمعات الخلايا البويضية عابس صعودا وهبوطا في الهيالورونيداس التي تحتوي على عقد المتوسطة مع ماصة الفم. مرة واحدة أنها خالية من خلايا الركام، واستخدام ماصة الفم لنقل كل بويضة إلى قطرة غسل تحتوي على المتوسط فقط عقد.
كرر هذا لكل قطرة الغسي