逆转录聚合酶链式反应（PCR）一直是mRNA定量的金标准。目前常用的两种检测方法为数字PCR（dPCR）1和定量实时PCR（qPCR）2。在这两种PCR技术中，dPCR比qPCR具有更高的灵敏度，提示其可能适用于单细胞中mRNA丰度的测定。然而，在我们的实验中，对每个样本包含5至10个卵母细胞的低丰度mRNA进行dPCR分析时，所得数据重复性差且变异程度高3。这可能是由于RNA提取和逆转录效率相关的实验误差所致。此外，已有研究对单个小鼠和人类卵母细胞进行了RNA测序4,5。该技术需要进行cDNA扩增步骤以构建文库，这可能会增加实验组内的变异性。此外，低丰度的转录本可能无法被检测到。尽管近年来测序成本有所下降，但由于生物信息学分析费用较高，整体成本仍可能难以承受。最后，mRNA的定位是一个动态过程，其空间分布的变化有助于蛋白质功能的实现6。因此，我们着手采用一种能够准确、可重复地定量并定位单个卵母细胞中单个mRNA的技术。
分支DNA与荧光原位杂交技术结合，通过放大荧光信号而非RNA/cDNA本身，实现对单个细胞中单个mRNA分子的检测7,8,9。该检测通过一系列杂交、扩增（利用分支DNA）和荧光标记步骤完成，以实现荧光信号的放大7。该技术首先使用18至25个碱基的寡核苷酸探针对，与特定mRNA序列互补结合3,8,10。针对每种转录本设计15至20对探针，以确保对目标转录本的特异性。在mRNA特异性杂交之后，引入预扩增子和扩增子探针，形成分支结构。每个扩增子可结合约400个荧光标记物，使荧光信号增强约8000倍，从而实现对单个mRNA分子的检测（图1）11。
图1：SM-FISH实验流程示意图。 图示为针对目标mRNA的转录本特异性探针、分支DNA扩增子及荧光团的依次杂交过程。请点击此处查看此图的放大版本。
既往研究利用单分子荧光原位杂交技术（SM-FISH）对单个神经元中的β-actin mRNA12以及宫颈癌细胞系中的人乳头瘤病毒DNA7进行了定位。计算机软件Spot Finding and Tracking Program可识别单个点状荧光信号，并已成功用于量化每个细胞中的mRNA数量3,13。
根据在神经元中检测mRNA的结果12，我们推测单分子荧光原位杂交（SM-FISH）可作为定量小鼠卵母细胞和胚胎中转录本水平的有效工具，包括丰度较低的mRNA。然而，该技术通常针对贴壁固定的细胞以及甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行优化。卵母细胞即使在涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上也无法贴附。此外，与体细胞和组织切片相比，卵母细胞更为脆弱，在接触商业试剂盒中某些专有缓冲液时容易发生细胞裂解3。为克服这些挑战，卵母细胞经固定后通过人工方式在不同缓冲液液滴之间转移。此外，试剂盒中的透化和洗涤缓冲液被替换，以减少细胞裂解的发生。预设计的探针可随FISH试剂盒一并购买，也可根据需要定制特定转录本的探针。每套专有探针均可提供三种荧光通道（C1、C2和C3）中的一种，以实现多重检测。在本实验中，小鼠卵母细胞使用C2通道的Nanog探针和C3通道的Pou5f1探针进行双重染色并定量。选择这些探针是基于Nanog和Pou5f1在卵母细胞和胚胎中已有报道的表达情况。完成杂交步骤后，将卵母细胞置于抗荧光淬灭封片介质的液滴中，随后转移至组织学载玻片上。采用共聚焦显微镜图像对代表单个mRNA的点状荧光信号数量进行定量。除了定量mRNA外，成像还可显示特定mRNA在细胞内的空间分布，这是其他RNA定量方法无法实现的。该技术在实验组内表现出较低的变异性，因此可在每个实验组中使用较少数量的卵母细胞即可识别出实验组间的显著差异3。
该技术不仅能够实现候选mRNA在单个卵母细胞和胚胎中的定位，还能对其进行定量分析。与其他检测方法（包括PCR）相比，该技术完成后的数据具有良好的可重复性且变异程度较低。本实验操作将由我实验室的研究生Kelsey Timme进行演示。
按照文本方案所述，从准备所需材料和5至8周龄的雌性小鼠开始此操作。用70%乙醇清洁小鼠。暴露腹腔并观察雌性生殖道。
用镊子夹住卵巢，去除卵巢周围子宫韧带及多余的脂肪组织。将输卵管从子宫上剪下。然后将卵巢-输卵管配对组织置于35毫米培养皿的温热保存液中。
取出卵巢及周围脂肪组织。使用半英寸27号针头撕开输卵管膨大的壶腹部。在撕裂处推动输卵管，即可挤出卵丘细胞-卵母细胞复合体。
使用口吸移液管将排出的卵母细胞转移至含有透明质酸酶的100微升持卵液液滴中。为去除卵丘细胞，用口吸移液管在含有透明质酸酶的持卵液中反复吹打处于第二次减数分裂中期的卵母细胞-卵丘细胞复合物。待卵母细胞完全去除卵丘细胞后，使用口吸移液管将每个卵母细胞转移至仅含持卵液的洗涤液滴中。
对每个洗涤液滴重复此操作。不要转移破碎或透明的卵母细胞。为进行SM-FISH染色，首先将卵母细胞固定在六孔板的单个孔中，孔内含有500 µL固定缓冲液。
将20个或更少的卵母细胞浸入孔中。在室温下用固定缓冲液孵育卵母细胞20分钟。按照文本方案中所述清洗卵母细胞后，在室温下用通透缓冲液孵育卵母细胞30分钟。
再次洗涤后，将卵母细胞转移至80微升预稀释的蛋白酶3缓冲液中，在室温下孵育30分钟。将预热的Nanog、Pou5f1和DapB探针组按1:50比例用探针稀释液稀释。将卵母细胞在80微升转录本特异性探针中于40摄氏度孵育2小时。
当卵母细胞处于探针和AMP缓冲液中时，它们 tends to float。必须通过轻轻将其推入缓冲液中使其完全浸没。将卵母细胞转移至500 µL洗涤缓冲液中，在室温下孵育10分钟。
现在，将卵母细胞依次在扩增缓冲液中孵育。首先，将卵母细胞在 80 µL 的 AMP1 中于 40 °C 孵育 30 分钟。然后将卵母细胞转移至 500 µL 洗涤缓冲液中，在室温下孵育 10 分钟。
接下来，将卵母细胞在 80 微升 AMP2 中于 40 摄氏度孵育 15 分钟。按照之前的方法洗涤卵母细胞后，将卵母细胞在 80 微升 AMP3 中于 40 摄氏度孵育 30 分钟，随后进行最后一次洗涤。最后，将卵母细胞加入 80 微升 AMP4FL 中于 40 摄氏度孵育 15 分钟。
用移液器吸取12微升抗荧光淬灭封片剂，滴加到载玻片中央，注意避免试剂中产生气泡。将卵母细胞连同尽可能少的洗涤缓冲液转移至封片剂中。最后，盖上盖玻片。
使用Z步进共聚焦显微镜对三维卵母细胞进行成像，并按照文本方案中所述保存图像。将ND2文件拖入Fiji软件，选择多维图像（Hyperstack）。点击“图像”（Image）选项卡