רוורס טרנסקריפטאז תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) כבר תקן זהב עבור כימות mRNA. שני מבחני, PCR (dPCR) דיגיטלי1 ו זמן אמיתי כמותיים PCR (qPCR)2 משמשים כיום. של שתי טכניקות PCR, dPCR יש רגישות רבה יותר מאשר qPCR רומז כי זה יכול לשמש כדי למדוד את שפע mRNA בתאים בודדים. עם זאת, בידיים שלנו, הפיק dPCR ניתוח של שפע נמוך mRNAs בבריכות של 5-10 oocytes לכל כל מדגם ניסיוני נתונים עם הפארמצבטית נמוך ווריאציה גבוהה3. . זה ככל הנראה בגלל השגיאה ניסיוני המשויך החילוץ-RNA ויעילות שעתוק במהופך. רצפי RNA גם בוצעה באמצעות עכבר אחת oocytes האנושי4,5. טכניקה זו דורשת cDNA הגברה השלבים הנדרשים עבור הדור ספריה אשר סביר להניח מגביר את השתנות בתוך קבוצת הניסוי. יתר על כן, שפע נמוך תעתיקים לא ניתן לזיהוי. למרות רצף המחירים ירדו בשנים האחרונות, הוא עדיין יכול להיות ושדורשת עקב העלות הגבוהה של ביואינפורמטיקה ניתוחים. לבסוף, mRNA לוקליזציה היא תהליך דינמי עם שינויים מרחביים התורמים חלבון פונקציה6. לכן, יצאנו לאמץ טכניקה היה לייצר אמצעי כמותית מדויקת לשחזור ולוקליזציה של הפרט mRNAs ב oocytes יחיד.
DNA מסועף מצמידים זריחה בהכלאה באתרו מגביר את האות זריחה במקום RNA/cDNA הגברה המאפשרת זיהוי mRNAs יחיד תאים בודדים- 7,-8,-9. הבדיקה מבוצעת דרך סדרה של הכלאה הגברה (באמצעות DNA קנים), קרינה פלואורסצנטית תיוג צעדים כדי להגביר את האות של קרינה פלואורסצנטית7. הטכניקה מתחילה עם קשירה של זוגות בדיקה oligonucleotide 18 - 25-לבסיס כי הם משלימים על ספציפיות mRNA3,8,10. 15-20 זוגות בדיקה מיועדים ירידה לפרטים הבטחת כל תורגם על-ידי היעד. הכלאה mRNA ספציפי ואחריו הגששים קדם מגבר, מגבר כי הטופס תצורה מסועף. כ, fluorophores תווית 400 לאגד כל מגבר, וכתוצאה מכך עלייה 8000-fold ב פלורסצנטיות המאפשר זיהוי של הפרט mRNAs (איור 1)11.
איור 1: סכימטי של פרוטוקול SM-דג- הכלאה רציפים של התעתיק בדיקה ספציפיים, כפועל DNA מגבר ו fluorophore ליעד mRNA מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
מחקרים קודמים באמצעות קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (SM-דג) לשפות אחרות β-אקטין mRNAs נוירונים בודדים12 , וירוס הפפילומה האנושי DNA של סרטן צוואר הרחם תא קווים7. תוכנת מחשב במקום למצוא תוכנית מעקב אחר מזהה אות ניאון punctate בודדים, שימש בהצלחה כדי לכמת את מספר mRNAs כל3,תא13.
בהתבסס על התוצאות של גילוי mRNA נוירונים12, אנחנו שיערו כי SM-דג יוכיח כלי שימושי כדי quantitate רמות תורגם מאתר oocytes, העוברים כולל שפע נמוך mRNAs. עם זאת, הטכניקה ממוטבת לשימוש עם תאים קבוע חסיד, פורמלדהיד קבוע פרפין משובצים קטעי רקמה (FFPE). Oocytes לא יכולה לדבוק שקופית, גם כאשר הם מצופים פולי-L-ליזין. יתר על כן, הן שבירות יותר תאים סומטיים ומקטעים רקמות וכתוצאה מכך פירוק התא כאשר נתון של המאגרים קניינית ערכות זמינים מסחרית3. כדי להתגבר על האתגרים הללו, oocytes היו קבוע, מועברים באופן ידני בין טיפות של המאגרים. יתר על כן, מאגרי permeabilization ושטוף ערכות הוחלפו כדי להפחית את פירוק התא. שתגבש רגשים נרכשים לצד ערכת דגים או תעתיקים ספציפי ניתן לבקש. כל ערכת בדיקה קניינית זמין באחד בשלושה ערוצי קרינה פלואורסצנטית (C1, C2, C3) כדי לאפשר ריבוב. בניסוי הנוכחי, oocytes מאתר היו שהוכתמו כפול, כימות באמצעות בדיקה C2 Nanog ובדיקה C3 Pou5f1 . רגשים אלו נבחרו מבוסס על הביטוי המדווחת של Nanog , Pou5f1 oocytes, העוברים. בסיום השלבים הכלאה, oocytes היו ממוקמים בתוך טיפות אנטי-לדעוך הרכבה מדיה עבור יישום בשקופיות היסטולוגית. תמונות קונאפוקלית שימשו כדי לכמת את מספר punctate אותות פלואורסצנט אשר מייצגים mRNAs בודדים. בנוסף לכימות של mRNAs, ההדמיה הראתה גם את התפוצה המרחבית של ה-mRNA ספציפי בתא, אילו שיטות כימות אחרים של RNA הם הצליחו. להגיע להישגים. טכניקה זו הוכיח יש השתנות נמוך בתוך קבוצת הניסוי המאפשר שימוש מספר קטן יחסית של oocytes בכל קבוצה ניסיונית כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי3.
טכניקה זו מאפשרת לא רק לוקליזציה, אלא גם כימות של mRNAs מועמד ב oocytes בודדים ועוברים. בהשוואה למסיונות אחרים, כולל PCR, השלמת הטכניקה גורמת לשחזור נתונים עם וריאציה נמוכה. הפגנת ההליך תהיה קלסי טים, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי.
התחל הליך זה עם הכנת החומר הנדרש ועכברים נקבה בגיל חמישה עד שמונה שבועות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. נקה את העכבר באמצעות 70%אתנול. לחשוף את חלל הבטן לדמיין את מערכת הרבייה הנשית.
החזק את השחלה עם מעצורים ולהסיר את רצועות הרחם ואת רקמת שומן עודף מסביב השחלה. חותכים את האוביאדוקט מהרחם. לאחר מכן, מניחים את זוג oviduct השחלה במדיום החזקה חם בצלחת 35 מילימטר.
הסר את השחלה ואת כל רקמת השומן שמסביב. לקרוע את האמפולה הנפוחה של oviduct באמצעות מחט מד חצי אינץ '27. לדחוף את oviduct באתר של דמעה קומולוס תא oocyte מתחמים יסולקו.
שימוש בפיפלטת פה להעברת הביציות הביוץ לירידה של 100 מיקרוליטר המכילה אחזקה בינונית עם היאלואורונידס. כדי לנטרל תאים קומולוס, פיפטה metaphase שני קומפלקסים תא cumulus oocyte למעלה ולמטה ב hyaluronidase המכיל מחזיק בינוני עם פיפטה הפה. ברגע שהם נטולי תאי קומולוס, השתמש פיפטה הפה להעביר כל oocyte טיפת לשטוף המכיל רק מחזיק בינוני.
חזור על זה עבור כל טיפת לשטוף. אין להעביר בוציטים מפוצלים או שקופים. לביצוע כתמי SM-FISH, תחילה תקן בוציטים באר בודדת של צל