逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) mRNA 定量の金の標準となっています。2 つの試金、デジタル PCR (dPCR)1および定量的なリアル タイム PCR (qPCR)2現在使用されます。2 つの PCR 技術の dPCR は qPCR 示唆それは単一細胞における mRNA 量測定に使用することができるよりも高い感度です。しかし、私たちの手で各実験サンプルあたり 5 に 10 卵母細胞のプールで低豊富 dPCR 解析は低再現性と高いバリエーション3データを生産しています。これは RNA の抽出および逆のトランスクリプションの効率性に関連する実験的なエラー可能性があります。RNA シーケンスも単一のマウスと人間の卵子4,5を使用して行われています。この手法には、ライブラリを生成可能性が実験群内変動を増加させるために必要な cDNA 増幅手順が必要です。さらに、低豊富な成績証明書を検出できない場合があります。シーケンスの価格は、ここ数年ダウンしている、バイオインフォマティクス解析のコストが高いため法外なコストすることができます。最後に、mRNA の局在は、タンパク質機能6に貢献して空間的変化とダイナミックなプロセスです。そのため、正確かつ再現可能な量的および単一卵母細胞個々 の mRNAs のローカリゼーションを生成する手法を採用に着手しました。
蛍光 in situ ハイブリダイゼーションと結合した分岐 DNA 増幅蛍光信号ではなく、個々 のセル7,8,9の単一の Mrna の増幅の RNA/cDNA 有効に検出します。アッセイは、一連のハイブリダイゼーション、増幅 (分岐 DNA を使用)、および蛍光蛍光信号7を増幅するための手順によって行われます。技術は、特定の mRNA3,8,10を補足 18-25 ベース オリゴヌクレオチド プローブ ペアの結合に始まります。15 ~ 20 プローブ ペアはターゲット トラン スクリプトの各トラン スクリプトの特異性確保のために設計されています。MRNA 固有の交配には分岐の構成を形成する前置増幅器と増幅器のプローブが続きます。約、400 ラベル fluorophores が付いては、各増幅器、蛍光は、個々 の mRNAs (図 1)11の検出の 8000-fold 増加の結果にバインドします。
図 1: SM 魚のプロトコルの概略図。トラン スクリプト特定のプローブの連続交配が枝分かれしたは、DNA 増幅器、蛍光 mRNA を示すターゲットに。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
個々 のニューロン12及び子宮頚癌におけるひと乳頭腫ウイルス DNA にその場交配 (SM 魚) ローカライズされた β-アクチン Mrna の 1 分子蛍光を使った過去の研究は、ライン7 をセルします。ソフト スポットを見つけると追跡プログラム個々 の点状蛍光信号を識別し、正常に各セル3,13における Mrna の数を定量化するために使用されています。
ニューロン12の mRNA の検出の結果に基づき、我々 は SM 魚、マウス卵子および胚など低豊富な Mrna の転写レベルを量的に便利なツールを証明することを仮定しました。しかし、付着固定細胞用技術に最適化されて、ホルムアルデヒド固定パラフィン包が (FFPE) ティッシュ セクションを埋め込んだ。卵母細胞は、ポリ L リジン コーティングしている場合でも、スライドに従うことはできません。さらに、彼らは体細胞およびティッシュ セクションのセル換散市販キット3で独自のバッファーの一部を受けたときの結果より壊れやすい。これらの課題を克服するために卵母細胞は固定され手動でバッファーの滴間で転送されます。さらに、キットに透過し、洗浄バッファーは、セル換散を減らすために取り替えられました。あらかじめデザインされたプローブは魚キットと一緒にご購入または特定のコピーを要求することができます。独自のプローブ セットは、3 つの蛍光チャンネル (C1、C2、および C3) を可能にする多重化の一つで利用可能です。現在の実験では、マウス卵母細胞がデュアル染色と定量化された C2 Nanogプローブと C3 Pou5f1プローブを使います。これらのプローブは、卵子および胚のNanogおよびPou5f1の報告された式に基づいて選ばれました。交配の手順の最後に、卵母細胞は組織学的のスライド用耐フェード マウント メディアの滴に置かれました。共焦点画像は、個々 の mRNAs を表す点状蛍光信号の数を定量化するために使用されました。定量化、Mrna イメージングも、セルの特定の mRNA の分布を示した他の RNA 定量メソッドもない達成することができます。この手法は、実験群3の重要な違いを識別するために各実験群の卵母細胞の小さい数字の使用を許可する実験群内変動の少ないを持っている証明しました。
この技術は、局所化だけでなく、個々の卵母細胞および胚における候補mRNAの定量化を可能にする。PCRを含む他のアッセイと比較して、この技術の完成は、低い変動で再現可能なデータをもたらします。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の大学院生であるケルシー・ティムです。
テキストプロトコルに記載されているように、5〜8週齢で必要な物質および雌マウスの調製からこの手順を開始する。70%エタノールを使用してマウスを洗浄してください。腹腔を露出し、女性の生殖管を可視化します。
鉗子で卵巣を保持し、卵巣の周りから子宮靭帯および過剰脂肪組織を除去する。子宮から卵管を切ります。次に、卵巣オビダクトペアを35ミリメートル皿に温かく保持する媒体に入れます。
卵巣および周囲の脂肪組織を取り除く。半インチ27ゲージ針を使用して、卵管の腫れた腫れを引き裂きます。涙液の部位で卵性を押すと、cumulus細胞卵母細胞複合体が排出されます。
口腔管を用いて排卵卵子をヒアルロニダーゼを含む保持媒体を100マイクロリットルに移した。乳雲細胞を外すために、口ピペットで保持媒体を含むヒアルロニダーゼ中の2つの卵母細胞を上下に代謝してピペットする。それらがcumulus細胞を欠いているら、口のピペットを使用して、各卵母細胞を保持媒体のみを含む洗浄液に移す。
洗い液滴ごとにこれを繰り返します。断片化または透明な卵母細胞を転送しないでください。SM-FISH染色を行うために、最初に500マイクロリットルの固定バッファーを含む6つのウェルプレートの個々のウェルに卵母細胞を固定します。
ウェルに20個以下の卵母細胞を水没する。室温で20分間固定バッファーに卵母細胞をインキュベートします。テキストプロトコルに記載されているように卵母細胞を洗浄した後、室温で30分間パーメレーションバッファーに卵母細胞をインキュベートする。
別の洗浄に続いて、卵母細胞を室温で30分間、あらかじめ希釈したプロテアーゼ3バッファーの80マイクロリットルに移します。ナノグ、Pou5f1、およびDapB用の温め合ったプローブセットをプローブ希釈で1~50に希釈します。転写物特異的プローブの80マイクロリットルで、摂氏40度で2時間培養します。
卵母細胞がプローブ内にあり、AMP バッファが動く傾向にあります。卵母細胞を緩やかにバッファに押し込んで水没させることが不可欠です。卵母細胞を500マイクロリットルの洗浄バッファーに移し、室温で10分間インキュベートします。
さて、卵母細胞を増幅バッファーに順次インキュベートする。まず、80マイクロリットルのAMP1で卵母細胞を摂氏40度で30分間インキュベートする。その後、卵母細胞を室温で10分間洗浄バッファーの500マイクロリットルに移します。
次に、80マイクロリットルのAMP2で卵母細胞を摂氏4