역전사 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) mRNA 정량에 대 한 황금 표준 되었습니다. 2 분석 실험, 디지털 PCR (dPCR)1 과 양적, 리얼 타임 PCR (정량)2 현재 사용 됩니다. 두 개의 PCR 기법, dPCR 그것은 단일 세포에서 mRNA 풍부를 측정 하는 데 사용할 수 제안 하는 정량 보다 더 큰 감도 있다. 그러나, 우리 손에 각 실험 샘플 당 5 ~ 10 oocytes의 수영장에서 낮은 풍부 mRNAs의 dPCR 분석은 생산 데이터 낮은 재현성 및 높은 변화3. 이 RNA 추출 및 반전 녹음 방송 효율성과 관련 된 실험적인 오류로 인해 높습니다. RNA 시퀀싱도 하나의 마우스와 인간의 oocytes4,5를 사용 하 여 수행 되었습니다. 이 기술은 가능성이 실험적인 그룹 내의 다양성을 증가 하는 라이브러리 생성에 필요한 cDNA 증폭 단계를 해야 합니다. 또한, 낮은 풍부 성적표 감지 하지 않을 수 있습니다. 시퀀싱 가격은 지난 몇 년 동안 추락, 비록 그것은 여전히 비용 생물 정보학 분석의 높은 비용 때문에 금지 수 있습니다. 마지막으로, mRNA 지역화 단백질 기능6에 기여 하는 공간 변경 동적 과정 이다. 따라서, 우리는 정확 하 고 재현 가능한 정량적 측정 및 단일 oocytes에서 개별 mRNAs의 지역화 생성 하는 기술 채택에 밖으로 설정.
분기 DNA 형광 제자리 교 잡에서에 결합 된 개별 셀 7,,89단일 mRNAs의 증폭 RNA/cDNA 활성화 탐지 보다는 형광 신호를 증폭 한다. 분석 결과 교 잡, 증폭 (분기 DNA를 사용 하 여), 및 형광 형광 신호7증폭 하기 위하여 단계를 라벨의 시리즈를 통해 수행 됩니다. 기술은 특정 mRNA3,,810를 보완 하는 18-25 베이스 oligonucleotide 조사 쌍의 바인딩으로 시작 합니다. 15 ~ 20 프로브 쌍 대상 성적에 대 한 각 사본 보장 특이성에 대 한 설계 되었습니다. MRNA 전용 하이브리드 프리 앰프 및 증폭기 프로브 분기 구성 구성 하 옵니다. 약, 400 라벨 fluorophores 개별 mRNAs (그림 1)11의 탐지를 허용 하는 형광에 8000-fold 증가 결과로 각 증폭기에 바인딩합니다.
그림 1: SM 물고기 프로토콜의 도식. 대 본 특정 조사의 순차적 교 잡 DNA 증폭기 및 mRNA 표시 대상에 fluorophore 분기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
개별 뉴런12 에 인간 유 두 종 바이러스 DNA에 자 궁 경부 암 제자리 교 잡 (SM-물고기) 지역화 된 β-말라 mRNAs에 있는 단일 분자 형광을 사용 하 여 이전 연구 라인7세포. 자리 찾기는 컴퓨터 소프트웨어 및 추적 프로그램 개별 punctate 형광 신호를 식별 하 고 각 셀3,13mRNAs의 수 척도를 성공적으로 사용 되었습니다.
신경12mRNA 검색의 결과 바탕으로, 우리 SM 물고기 quantitate murine oocytes에서 배아 낮은 풍부 mRNAs를 포함 한 성적 수준에 유용한 도구를 증명할 것을 가정 했다. 그러나, 기술은 부착 고정된 셀과 함께 사용 하기 위해 최적화와 포름알데히드 파라핀 고정 임베디드 (FFPE) 조직 단면도. Oocytes 그들은 폴 리-L-리 신을 코팅 하는 경우에 슬라이드를 준수 수 없습니다. 또한, 그들은 체세포와 직물 단면도 세포 세포의 용 해 상용 키트3독점 버퍼의 일부를 받게 될 때의 결과 보다 더 약 합니다. 이러한 과제를 극복 하기 위해 oocytes는 고정 되었고 수동으로 버퍼의 방울 사이 전송. 또한, 키트에 permeabilization 및 워시 버퍼 세포 세포의 용 해를 감소 시키기 위하여 대체 되었다. 미리 디자인 된 프로브 물고기 키트와 함께 구입 또는 특정 성적 증명서를 요청할 수 있습니다. 각 독자적인 프로브 세트는 3 개의 형광 채널 (C1, C2, 및 C3) 다중화 허용 중 하나에. 현재 실험에 murine oocytes 듀얼 스테인드과 C2 Nanog 프로브와 C3 Pou5f1 프로브를 사용 하 여 계량 했다. 이 프로브 oocytes에서 배아 Nanog 와 Pou5f1 의 보고 된 식에 따라 선정 됐다. 교 잡 단계의 결론에 oocytes 조직학 슬라이드에 응용 프로그램에 대 한 방지 페이드 설치 미디어의 방울에 배치 했다. 공초점 이미지 개별 mRNAs를 대표 하는 punctate 형광 신호 수 계량에 사용 되었다. 영상 또한 셀에 특정 mRNA의 공간적 분포를 보였다는 mRNAs를 측정 이외에 다른 RNA 정량화 방법 달성할 수 없습니다. 이 기술은 실험 그룹3사이의 중요 한 차이점을 식별 하기 위해 각 실험 그룹에 oocytes의 작은 숫자의 사용을 허용 하는 실험적인 그룹 내에서 낮은 다양성을 입증 했다.
이 기술은 지역화뿐만 아니라 개별 난모세포 및 배아에서 후보 mRNA의 양도 허용합니다. PCR을 포함한 다른 분석법과 비교하여 이 기술의 완성으로 인해 변동이 낮은 재현 가능한 데이터가 생성됩니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 켈시 팀메 (Kelsey Timme)가 될 것입니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 5~8주에 필요한 물질 및 여성 마우스의 준비로 이 절차를 시작합니다. 70%에탄올을 사용하여 마우스를 청소하십시오. 복강을 노출하고 여성 생식 기관을 시각화합니다.
난소를 집게로 잡고 난소 주위에서 자궁 인대와 과도한 지방 조직을 제거하십시오. 자궁에서 oviduct를 잘라. 그런 다음 난소 oviduct 쌍을 35 mm 접시에 따뜻한 홀딩 배지에 놓습니다.
난소와 주변 지방 조직을 제거합니다. 반 인치 27 게이지 바늘을 사용하여 oviduct의 부어 오른 앰풀라를 찢습니다. 눈물의 부위에 oviduct를 밀어 내고 적수 세포 난낭 복합체가 추방됩니다.
구강 파이펫을 사용하여 배란된 난소세포를 히알루로니다아제로 보유 하는 매체를 포함 하는 100 마이크로 리터 드롭에 전송. 적혈구를 제거하기 위해, 메타상 2 개의 난낭 수중 세포가 구강 파이펫으로 배지를 보유하는 히알루로니다제에서 위아래로 복합체를 피펫한다. 적혈구가 없는 후에는 입 파이펫을 사용하여 각 난미세포를 매미만 포함하는 세척 방울로 옮깁니다.
각 세척 액적당이 반복됩니다. 조각화되거나 투명한 난모세포는 전송하지 마십시오. SM-FISH 염색을 수행하려면 먼저 고정 버퍼 500 마이크로리터를 포함하는 6개의 웰 플레이트의 개별 우물에서 난모세포를 수정합니다.
우물에 20 개의 난모세포 이하를 잠급하십시오. 실온에서 20분 동안 고정 버퍼에 난모세포를 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 난모세포를 세척한 후, 실온에서 30분 동안 충혈 버퍼로 난모세포를 배양한다.
또 다른 세척후, 전액을 80 마이크로리터로 옮기면 실온에서 30분 동안 3개의 버퍼를 미리 희석한 프로테아제3버퍼로 옮깁니다. 나노그, Pou5f1 및 DapB에 대한 온난한 프로브 세트를 프로브 희석제에서 1~50으로 희석합니다. 40섭씨에서 2시간 동안 성적증명서 의 80마이크로리터에 난모세포가 인큐베이션됩니다.
난모세포가 프로브와 AMP 버퍼에 있을 때 부유하는 경향이 있습니다. 버퍼에 부드럽게 밀어 넣으면 난모를 담는 것이 필수적입니다. 난모를 500 마이