معالجة سائل غسل القصبات الهوائية والدم المتطابق لماكروفاج النفيل وCD4⁺ النمط المناعي للخلايا T وتقييم خزان فيروس نقص المناعة البشرية

فيروس نقص المناعة البشرية غير قابل للشفاء بسبب استمراره في الخزانات الخلوية والتشريحية. هذه الطريقة تسمح لتقييم مخزون فيروس نقص المناعة البشرية للخلايا المناعية المعزولة عن الرئتين. هذه التقنية تسمح عزل الخلايا التائية المخاطية الرئوية وضامة السنخية من سائل BAL لمزيد من التقييم الظاهري أو الفياروك كخزانات خلوية لفيروس نقص المناعة البشرية.

إن فهم بيولوجيا الضامة السنخية والخلايا التائية المصابة ب CD4 ومساهمتها في خزان فيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن يؤدي إلى رؤى مهمة حول التحديات التي تواجه علاج فيروس نقص المناعة البشرية. يمكن تطبيق عزل الضامة الأولية عن BAL على مختلف المجالات البحثية الأخرى، بما في ذلك الأمراض الرئوية الالتهابية أو المعدية مثل الربو والسل. بعد الحصول على السائل BAL من المريض البشري وفقا للبروتوكولات القياسية، دوامة السائل في أنبوب جمع الأصلي قبل نقل العينة إلى أنبوب 50 ملليلتر داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.

إذا ظهر السائل عكرًا جدًا أو ملوثًا بأنسجة خيوطية ، فتصفية العينة من خلال فلتر شبكة نايلون سعة 70 ميكرومترًا في أنبوب جديد سعة 50 ملليلترًا. بعد الطرد المركزي، نقل عظمى إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر واستخدام طرف ماصة لتفريق بلطف بيليه تحتوي على خلايا BAL كله. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من 1640 1640 متوسطة و إضافة ملليلتر واحد من عظمى محفوظة من كل من 10 1.5 ملليلتر أنابيب microcentr.

إضافة 10 ملليلتر aliquots من المتبقين في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر ووضع كل من العينات الفائقة في التخزين ناقص 80 درجة مئوية. تخفيف تعليق خلية بيليه في 10 ملليلتر من المتوسطة لكل 25 ملليلتر من العينة الأصلية وجمع خلايا BAL عن طريق الطرد المركزي. ثم resuspend بيليه في ملليلتر واحد من المتوسطة تستكمل مع مصل الأبقار الجنينية 10٪، أو FBS، للعد.

لفرز كامل BAL والخلايا أحادية النوى الدم الطرفية، إضافة خمس مرات 10 إلى الخلايا الخمس إلى كل من اثنين من أنابيب البوليسترين 5 ملليلتر مستديرة القاع لكل مجموعة فرعية لضوابط التعويض غير المهترصة والقابلة للحياة والملطخة وإضافة بقية كل عينة فرعية في أنبوب واحد خمسة ملليلتر لكل عينة. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة فرض الكريات السيطرة في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب على الجليد حتى يتم استخدامها. Resuspend الكريات من الخلايا لفرز في 250 ميكرولترات من واحد في 20 تخفيف مستقبلات FC العازلة لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية لمنع أي ربط غير محددة.

في نهاية الحضانة منع، إضافة مزيج مناسب من الجسم المضاد من الفائدة لاحتضان إضافية لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. في نهاية حضانة الأجسام المضادة الأولية، إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني إلى كل أنبوب للطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 250 ميكرولترات من التخزين المؤقت الفرز على الجليد المحمية من الضوء حتى الفرز. لإعداد ضوابط التعويض، إضافة ثلاث قطرات كل من الخرز التعويض الغلوبولين المناعي المضادة للماوس والخرز التعويض التحكم السلبي لكل ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب microcentrifuge ونقل 100 ميكرولترات من الحل حبة إلى كل عينة لاستخدامها في التعويض.

إضافة ميكرولتر واحد من كل جسم مضاد في الكوكتيل إلى كل أنبوب منفصل يحتوي على الخرز وإضافة ميكرولتر واحد من وصمة عار قابلة للحياة لكل أنبوب مراقبة تعويض البقعة قابلة للحياة. بعد 20 دقيقة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء، وغسل العينات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب وإعادة تعليق الكريات في 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد لكل أنبوب. قم بتحميل عينة التحكم غير المُطَرَّفة في خلية “بال” بالكامل على مقياس التدفق الخلوي وإعداد مصفوفة التعويض.

المقبل تحميل أنبوب العينة وفرز الخلايا تحت ضغط منخفض، الغاء لاستبعاد الضوضاء، لتشمل الخلايا الحية وCD45 إيجابية، واستبعاد doublets. داخل أكبر عدد من النخاع، وفرز CD206 وD169 الخلايا الإيجابية المزدوجة كما الضامة السني. داخل السكان أصغر الليمفاوية، عزل الخلايا إيجابية CD3 وفرز السكان CD4 و CD8 إيجابية واحدة.

لفرز عينة خلايا الدم أحادية النوى الطرفية، بوابة لاستبعاد الضوضاء و doublets وتشمل الخلايا CD45 إيجابية حية كما هو موضح. بعد أن أُورة على CD3، بوابة الخلايا CD3-سالبة، CD14-positive لفرز أحادية أحادية الإيجابية وبوابة الخلايا CD3-positive، CD4، وD8-positive لفرز كل من السكان إيجابية واحدة. عند عد عينة كامل-BAL، يمكن تصور أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك أكبر، الضامة جولة وأصغر، الخلايا الليمفاوية الجولة.

الضامة هي نوع الخلية الأكثر وفرة في سائل BAL، وهو ما يمثل حوالي 85٪ من الخلايا في الرئتين غير المدخن. وتثري هذه الخلايا في المدخنين لدرجة تبدو حصرية تقريبا وتميل إلى أن تكون موسعة بنحو 40٪ مقارنة مع الضامة لوحظت في غير المدخنين. تم اختيار العلامات المستخدمة لفرز الضامة السنخية من عينات السوائل BAL على أساس الأنماط الظاهرية الموصوفة مسبقًا من الضامة السنخية ، مثل مستقبلات mannose CD206 الموجودة على الخلايا البلعائية ومستقبلات sialoadhesin CD169.

بعد عزلتها، يمكن استخدام الضامة السنخية وأنواع الخلايا الأخرى للمناعة عن طريق قياس التدفق الخلوي، المقايسات الوظيفية المناعية، أو قياس كمية الخزان بواسطة PCR شديد الحساسية. وتتيح هذه التقنية الوصول إلى الضامة النقية للغاية في الأنسجة المقيمة، والتي كان من الصعب تاريخياً تحقيقها، مما يسمح بالفحص الذي كان بعيد المنال من قبل لكبر عدد الخلايا المناعية.