Immunology and Infection
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Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana
Chapters
Summary May 21st, 2019
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Cet article décrit deux méthodes pour quantifier des réponses de défense dans Arabidopsis thaliana suivant l'exposition aux eliciteurs immunisés : l'éclatement oxydant transitoire, et l'inhibition de la croissance de plant.
Transcript
Ces analyses peuvent être utilisées pour évaluer et comparer les extrants immunitaires de différents génotypes végétaux. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles sont rapides, fiables et utilisent des équipements de laboratoire communs. Pour l’essai d’inhibition de croissance, les semis de la même taille et âge devraient être transplantés et complètement effacés secs avant de peser pour limiter la variation.
À quatre à cinq semaines après la germination, utilisez un poinçon pointu de biopsie de quatre millimètres pour enlever un disque de feuille par plante d’Arabidopsis, évitant la midvein et prenant soin de limiter la blessure. Recueillir les disques dans des puits individuels d’une plaque de luminomètre inutilisée de 96 puits contenant 100 microlitres d’eau double distillée par puits, côté adaxial vers le haut, pour éviter la dessication. Si vous évaluez plusieurs facteurs d’obtention, retirez un deuxième disque de feuille de la même feuille pour chaque traitement d’elicitor, et couvrez la plaque avec le couvercle pour permettre aux disques de feuille de récupérer pendant la nuit à température ambiante.
Le lendemain matin, définissez les paramètres du lecteur de microplaques à un temps d’intégration de 1 000 millisecondes en intervalles de deux minutes sur une période de 40 à 60 minutes pour capturer l’éclatement oxydatif dynamique. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour remplacer l’eau de chaque puits par 100 microlitres de solution de réaction fraîchement préparée, y compris un contrôle, aucune réaction de elicitor pour chaque génotype pour évaluer les niveaux basaux d’espèces d’oxygène de réaction en l’absence d’obtention. Ensuite, mesurez immédiatement l’émission de lumière pour toutes les longueurs d’onde dans le spectre visible sur le lecteur de microplaque.
À quatre jours après la germination, chargez chaque puits d’une plaque de 48 puits avec 500 microlitres de moyenne de SP complétés par une dilution du peptide de elicitor. Ensuite, utilisez des forceps stériles pour transplanter soigneusement six à huit semis de la même taille, âge et génotype à chaque dilution peptidique, en prenant soin qu’il n’y a aucun dommage au semis ou à la rupture de la racine et que la racine est immergée dans le milieu. Lorsque tous les semis ont été plaqués, sceller les plaques avec du ruban Micropore et placer les plantes dans des conditions standard de courte journée pendant huit à 12 jours.
Pour déterminer l’inhibition de croissance en pourcentage, prenez une photo pour enregistrer visuellement l’inhibition de la croissance avant d’enlever soigneusement les semis de chaque puits. Ensuite, tamponnez les racines sur une serviette en papier pour sécher, et pesez chaque semis sur une échelle analytique. Dans cette expérience représentative, les plantes mutantes avec la signalisation immunisée hyperactive ont démontré un éclat oxydant cumulatif et moyen plus élevé comparé aux usines d’Arabidopsis sauvage-type, alors que les usines mutantes avec la signalisation immunisée altérée ont montré un éclat oxydant réduit aux concentrations entre 10 et 1.000 nanomolar.
Les différences attendues dans l’inhibition de la croissance des semis pourraient également être discernées entre tous les génotypes cultivés dans 100 et 1000 concentrations nanomolaires de peptide de elicitor. Lorsqu’ils sont cultivés dans la dilution peptidique de 1000 nanomolaires, les mutants ayant une signalisation immunitaire hyperactive étaient nettement plus petits que les plantes de type sauvage cultivées dans les mêmes conditions, tandis que les mutants ayant une signalisation immunitaire altérée présentaient une faible inhibition de la croissance par rapport aux plantes de type sauvage. Ces méthodes fournissent des preuves de réponses immunitaires précoces et tardives.
Plusieurs autres techniques, y compris les analyses de kinase MAP, l’expression des gènes induits par les pathogènes et les analyses d’infection, peuvent être utilisées pour délimifier ces voies. Ces techniques ont été modifiées pour être utilisées dans des écrans à grande échelle, qui ont permis d’identifier avec succès les protéines des récepteurs pathogènes et plusieurs autres composants de signalisation.
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