使用标准化定量 Western Blotting 在不同组织及发育过程中对蛋白质水平进行稳健比较

Western blotting 是一种常用于检测和定量蛋白质表达的技术，包括在组织匀浆或提取物中的蛋白质。多年来，该技术推动了基础研究和临床研究的许多进展，在临床中可用作诊断工具，以识别疾病的存在^1,2。Western blotting 于1979年首次被描述，其方法是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜上，随后使用标记有放射性物质或与荧光素或过氧化物酶偶联的二抗来可视化蛋白质³。随着商业化试剂盒和设备的发展，Western blotting 方法在近年来已日益标准化和简化。事实上，如今不同背景和经验水平的科研人员均可轻松开展该技术。然而，与许多类似的实验技术一样，Western blot 分析的结果极易受到实验设计和操作过程中各项选择的影响。因此，尽管标准化的 Western blotting 方法易于获取，但仍必须认识到精心的实验规划与设计不可或缺。实验中需考虑的因素包括但不限于样品的制备与处理、用于蛋白质检测的抗体的选择与验证，以及特别小或大（<10 或 >140 kDa）蛋白质从凝胶向膜转移的效率^4,5,6,7,8,9。原始样品中蛋白质的质量对后续 Western blot 分析结果具有重要影响。由于蛋白质可从多种样品和来源中提取，包括细胞系、动物模型组织以及死后人体组织，因此必须保持处理和操作的一致性，以获得可重复的结果。例如，当需要长期储存样品用于蛋白质提取时，应认识到尽管蛋白质在 -80 °C 下通常较为稳定，但已有报道指出提取后的蛋白质与完整组织在 -80 °C 下的稳定性存在差异¹⁰。此外，为了获得可重复的蛋白质定量结果，样品均一化的处理至关重要。在开展大规模定量实验之前，可能需要优化不同的裂解缓冲液和均质化方法（例如手动均质化与自动化方法的比较）。

为校正蛋白上样量和定量过程中的变异，采用标准化策略对于获得可靠且定量的蛋白表达结果至关重要。传统上，常使用看家蛋白（如 β-actin、α-tubulin、β-tubulin 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH））对蛋白水平进行标准化以实现定量。然而，近年来，针对特定看家蛋白进行定量标准化的方法受到越来越多的质疑^11,12。例如，看家蛋白的表达水平在不同发育阶段^13,14、同一动物的不同组织之间⁴，以及在多种疾病状态下^4,15,16,17均可能发生改变。因此，依赖特定看家蛋白进行标准化会限制在不同组织、不同时间点以及不同实验条件下进行更复杂蛋白表达比较的可能性。为控制蛋白上样差异，一种替代看家蛋白的方法是使用总蛋白染色（TPS），该方法可标记并可视化样品中所有存在的蛋白。TPS 能够基于总蛋白载量而非单一特定蛋白的表达水平进行信号标准化，因此 TPS 信号的定量结果应在不同实验条件、样品类型或发育时间点之间具有可比性和可重复性。总蛋白染色的示例包括 Ponceau S、免染胶、Coomassie R-350、Sypro-Ruby、Epicocconone、Amydo Black 和 Cy5（详见参考文献18）。这些方法各有其特定的优势与局限性，具体方法的选择取决于可用的时间、工具以及实验设计^4,18。

除了使用总蛋白上样量标准化（TPS）方法来校正膜内上样和定量的差异外，在不同膜之间进行样本比较也可能是必要的，尤其是在进行大规模蛋白质表达分析时。然而，由于抗体结合效率、总蛋白染色强度等因素的差异，可能会在分别运行于不同凝胶和转印膜上的蛋白质样本之间引入额外的变异。因此，在这种情况下，为了实现可靠的定量分析，有必要引入进一步的归一化步骤，以校正膜间差异。这一目标可通过在每张独立分析的膜上均加入一个内部上样标准品来实现，该标准品在各次实验中保持恒定。该标准品可以是任何能够获得足够数量的蛋白裂解液，以便在实验所涉及的所有膜上使用。本文中我们采用小鼠脑组织裂解液（来源于5日龄对照小鼠），因为脑组织易于匀浆，且所得蛋白裂解液含有较高浓度的丰富蛋白。将内部标准品以三复孔形式上样，即可实现对不同膜上样本的归一化和直接比较。

本文中，我们描述了一种已开发的详细实验方案，可用于在不同组织、小鼠模型（包括疾病模型）以及发育时间点之间进行复杂的蛋白质表达差异比较¹⁹。通过将荧光总蛋白染色（TPS）与内参上样标准相结合，我们克服了单次实验中可比较的样本数量和实验条件的现有局限性。该方法拓展了传统蛋白质印迹技术的应用，使研究人员能够更深入地探究不同组织和样本间的蛋白质表达情况。