סופג המערבי היא טכניקה המשמשת בדרך כלל כדי לזהות ולכמת ביטוי חלבון, כולל רקמות homogenates או תמציות. במהלך השנים, טכניקה זו הובילה רבים ההתקדמות במחקר בסיסי וקליני, שבו הוא יכול לשמש ככלי אבחוני כדי לזהות הנוכחות של מחלה¹^,². סופג המערבי תוארה לראשונה בשנת 1979 כשיטה כדי להעביר חלבונים לזיהוי ג'לים ניטרוצלולוזה גליונות והמחש לאחר מכן חלבונים באמצעות נוגדנים משניים radioactively מתויג או מצומדת כדי fluorescein . או peroxidase³... דרך פיתוח ערכות זמינים מסחרית, ציוד, שיטות סופג המערבי יש יותר ויותר סטנדרטית, פשוטה עם השנים. אכן, הטכניקה עכשיו בקלות מתבצעת על ידי מדענים עם רקעים ורמות שונות של ניסיון. עם זאת, כמו עם טכניקות רבות ניסיוני דומה, התוצאה של ניתוח תספיג בקלות מושפעת האפשרויות עיצוב, ביצוע הניסוי. זה חשוב, לכן, כי הנגישות של מתוקננת שיטות מערביות סופג לא יטשטשו את הצורך תכנון ניסויי זהיר ועיצוב. שיקולים ניסיוני כוללים, אך אינם מוגבלים, לדוגמא, טיפול, בחירה והכנה אימות של נוגדנים לגילוי חלבון ויעילות ג'ל-כדי-הממברנה העברה של קטן או גדול במיוחד (< 10 או > 140 kDa) חלבונים⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. חלבון איכותי של המדגם המקורי ממלאת תפקיד משמעותי בקביעת התוצאה של הניתוח תספיג עוקבות. כמו חלבון יכול להיות מופק מגוון רחב של מקורות, כולל שורות תאים, רקמות חייתיים של פוסט-מורטם ברקמות אנושיות, ודוגמאות עקביות בטיפול ועיבוד נדרש כדי להשיג תוצאות לשחזור. לדוגמה, כאשר נדרש אחסון לטווח ארוך של דגימות לחילוץ חלבון, זה חשוב להבין כי למרות חלבון יציב בדרך כלל ב-80 מעלות צלזיוס, ההבדלים חלבון יציבות בין חלבונים שחולצו ורקמות שלם ב- 80 ° C כבר דווח על¹⁰. יתר על כן, כדי לקבל הערכות לשחזור של כמויות חלבון, המגון עקבית של דגימות היא קריטית. אופטימיזציה של מאגרי פירוק שונים ושיטות המגון (למשל, ידני המגון בהשוואה בשיטות אוטומטיות) עשוי להידרש לפני התחלת ניסוי כמותי בקנה מידה גדול.

נורמליזציה אסטרטגיות לתיקון השתנות וטעינה של כימות חלבונים חיוניים כדי להשיג תוצאות חזקות, כמותית של ביטוי חלבון. ניהול משק בית חלבונים כגון β-אקטין, α-טובולין, β-טובולין, גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) מסורתי שימשו לנרמל את רמות החלבון על כימות. עם זאת, נורמליזציה משק מסוים חלבונים למטרות כימות יותר ויותר ביקורת על העבר כמה שנים¹¹^,¹². לדוגמה, הביטוי של חלבונים משק בית יכול להשתנות על פני שלבים התפתחותיים שונים¹³^,¹⁴, מעבר ברקמות של בעלי חיים מאותו⁴, ותחת שונים המחלה התנאים⁴^,¹⁵¹⁶^, ^,¹⁷. לכן, השימוש של חלבונים ספציפיים משק מגביל את האפשרויות של הפיכת מורכבים יותר השוואות בין ביטוי חלבון מ ברקמות שונות, timepoints שונים, תחת משתנה תנאי הניסוי. אלטרנטיבה משק החלבונים כדי לשלוט על חלבון טעינת וריאציה הוא השימוש של כתם חלבון הכולל (TPS) את התוויות, מדמיין כל החלבונים הנוכח במדגם. תוכנית-המיתאר מאפשר נורמליזציה אות המבוסס על עומס חלבון הכולל יותר מאשר רמות של חלבון ספציפי אחד, ולפיכך כימות של תוכנית-המיתאר אות צריך להיות דומים ואף לשחזור ללא תלות במצב ניסיוני, סוג הדגימה או timepoint התפתחותית . דוגמאות חלבון הכולל כתמי צבע מאכל פונסו S העיניינים ג'לים, Coomassie R-350, עברית, Epicocconone, Amydo השחור, Cy5 (שבתוך הפניה למעורר 18). כל השיטות האלה יש יתרונות ספציפיים ומגבלות, שיטת הבחירה תלויה בזמן, כלים זמינים, כמו גם את הגדרת הניסוי⁴^,¹⁸.

בנוסף לשימוש תוכנית-מיתאר כדי לתקן בתוך-הממברנה וטעינה של כימות השתנות, ייתכן צורך להשוות בין דגימות בין ממברנות שונות, במיוחד בעת ביצוע ניתוח ביטוי חלבונים בקנה מידה גדול. עם זאת, השתנות של גורמים כמו הנוגדן מחייב יעילות וסיכום בעוצמה הכתם חלבון יכול להכיר עוד יותר השתנות בין דגימות חלבון זה מנותחים על ג'לים נפרד ממברנות. על כימות חזקים במצב הזה, לכן שצריך להציג צעד נוסף נורמליזציה להביא בחשבון השתנות בין-הממברנה. זו יכולה להיות מושגת על-ידי הכללת תקן הטעינה פנימי בכל אחד הקרומים בנפרד שנותחה נשמר קבוע לאורך ניסויים. תקן זה יכול ללבוש הצורה של כל חלבון lysate זה ניתן להשיג בכמויות מספיקות כדי לשמש מעבר ממברנות כל כלול את הניסוי. כאן, אנו משתמשים lysate של מוח העכבר (המתקבל עכברים פקד בן 5 יום), המוח הוא הומוגני ברצון, החלבון שהושג lysate מכיל כמות משמעותית של חלבון-ריכוז גבוה. טעינת תקן פנימי שהפקידים מאפשר דוגמאות על ממברנות נפרד מנורמל, בהשוואה ישירות.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט פותחו כדי לאפשר לנו לבצע השוואות מורכבות של חלבון ביטוי וריאציה על פני ברקמות שונות, מודלים העכבר (כולל מודלים המחלה), התפתחותיים timepoints¹⁹. על ידי שילוב תוכנית-מיתאר פלורסנט עם השימוש טעינת פנימי סטנדרטי, הצלחנו להתגבר על מגבלות הקיימות מספר דוגמאות ומצבים ניסיוני ניתן להשוואה במסגרת ניסוי יחיד. גישה זו מרחיבה את השימוש בטכניקות מסורתיות תספיג, ובכך לאפשר לחוקרים לחקור יותר חלבון הביטוי על פני ברקמות שונות ודוגמאות.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לענות על שאלות חשובות במחקר בסיסי וקליני על ידי התבוננות ביטוי חלבון על פני רקמות שונות ונקודות זמן. כדי לבצע כתמים מערביים כמותיים אמינים, אנו משלבים כתם חלבון כולל פלואורסצנטי עם בקרת טעינה פנימית. זה מתגבר על מגבלות המתעוררות בעת השוואת רקמות שונות על פני תנאים ניסיוניים.

כדי לחלץ חלבונים מדגימות תאים או רקמות קפואות, הפשיר את הדגימות של מינוס 80 מעלות על קרח לפני שטיפת הדגימות לפי הצורך, על פי הטבלה. באמצעות homogenizer חשמלי כף יד עם עלה פוליפרופילן, הומוגניזציה דגימות שטף, לשטוף את העלי במים מזוקקים כפול וייבוש עם רקמה נקייה בין דגימות. השאירו את הדגימות על הקרח למשך 10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה.

לאחר מכן, להעביר את החלבון-מדגם המכיל supernatant לצינור חדש על הקרח מבלי להפריע גלולה. לכמת את ריכוז החלבון, להגדיר תקני אלבומין בסרום חזיר בריכוזים הולכים וגדלים ב- triplicate, ולהוסיף microliter אחד של כל דגימת חלבון כפול ל בארות המתאימות של צלחת אופטית 96-well. דגירה החלבון על בלוק חום 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או יותר אם ריכוז החלבון צפוי להיות נמוך ולמדוד את הספיגה ב 560 ננומטר על קורא צלחת.

יצא את מדידות קורא הלוחות וחשב את ריכוז החלבון על-ידי השוואת ערכי הספיגה הממוצעים של כל דגימה לעקומה סטנדרטית המתקבלת באמצעות תקן החלבון. כדי לנרמל את כמות החלבון,

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג