단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

서 부 럽 일반적으로 감지 단백질 표정, 조직 homogenates 또는 추출 물 등을 계량 하는 데 사용 되는 기술입니다. 년 동안,이 기술을 주도하 고 있다 기본 및 임상 연구에 많은 발전을 그것은 사용할 수 있는 진단 도구로 질병^1,2의 존재를 확인 하. 서 부 럽 처음에 설명 되었다 1979 니트로 시트 polyacrylamide 젤에서 단백질을 전송 후 했다 방사성으로 분류 하거나 fluorescein에 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 단백질을 시각화 하는 방법으로 또는 과산화 효소³. 상용 장비 및 장비 개발을 통해 서쪽 더 럽 히 방법은 점점 표준화 하 고 되었습니다 년간 단순화. 실제로, 기술은 다양 한 배경과 경험의 수준의 과학자 들에 의해 쉽게 수행 이제 됩니다. 그러나, 많은 유사한 실험 기법, 것과 같이 서쪽 오 점 분석의 결과 쉽게 영향을 설계 및 실험의 실행에서 만든 선택. 그것은 중요 한, 그러므로, 표준화 된 서쪽 더 럽 히 메서드의 액세스 가능성 모호한 실험 계획에 대 한 필요성 및 디자인 하지 않습니다. 실험적인 고려 사항 포함, 하지만 제한, 샘플 준비 및 처리, 선택 및 단백질 검출을 위한 항 체의 유효성 검사 및 특히 소형 또는 대형의 젤 막 전송 효율 (< 10 또는 > 140 kDa) 단백질^4,,56,7,,89. 원래 샘플의 단백질 품질 후속 서쪽 오 점 분석의 결과 결정에 중요 한 역할을 한다. 단백질 샘플 및 세포, 조직, 동물 모델에서 사후 인간의 조직, 등의 다양 한에서 추출 될 수로 처리 및 처리에 일관성 재현성 결과를 얻이 필요 합니다. 예를 들어 단백질 추출에 대 한 샘플의 장기 보관이 필요한 경우 그것은, 단백질은-80 ° C에 일반적으로 안정, 추출 된 단백질 및-80 ° C에서 그대로 조직 단백질 안정성에 차이 되었다는 것을 실현 하는 것이 중요 보고 된¹⁰. 또한, 단백질 양의 재현할 수 견적을 얻으려면, 샘플의 일관 된 균질 결정적 이다. 다른 세포의 용 해 버퍼 및 균질 화 방법 (예를 들어, 수동 균질 자동된 방법에 비해)을 최적화 하는 것은 대규모 양적 실험을 시작 하기 전에 필요할 수 있습니다.

단백질 로드와 부 량 변화에 대 한 해결 하기 위해 정규화 전략 단백질 식의 강력 하 고, 양적 결과 얻기 위해 필수적입니다. 단백질 β-말라 등 내부 관리, α-tubulin, β-tubulin, 및 glyceraldehyde-3-인산 효소 (GAPDH) 전통적으로 사용 되어 왔습니다 정량화에 대 한 단백질 수준을 정상화 하. 그러나, 정량화 목적을 위해 특정 가사 단백질 정규화 점점 받아왔다 지난 몇 년 동안^11,12이상. 예를 들어 가사 단백질의 표현 같은 동물⁴, 그리고 다양 한 질병 조건^{4,15 아래 조직에 걸쳐 서로 다른 발달 단계13,14를 변경할 수 있습니다. ,,1617}. 따라서, 특정 가사 단백질의 사용 다른 조직, 다른 timepoints와 다양 한 실험 조건 아래에서 단백질 표정 사이 더 복잡 한 비교를 만들기의 가능성을 제한 합니다. 로드 변형 단백질에 대 한 제어를 가사 단백질 대신 총 단백질 얼룩 (TPS)를 사용 하 여 해당 레이블 이며 샘플에 존재 하는 모든 단백질을 시각화. TPS 신호 정규화 총 단백질 부하에 따라 수 보다는 특정 한 단백질의 수준 및 그러므로 TPS 신호의 정량화 해야 한다 비교 실험 조건, 샘플 형식 또는 발달 timepoint에 재현 . 총 단백질 얼룩 포함 됩니다 Ponceau S, 얼룩-무료 젤, Coomassie R-350, Sypro-루비, Epicocconone, Amydo 블랙와 Cy5 (참고 18에서 검토). 이러한 각 메서드는 특정 이점 및 제한 하 고 메서드 선택 실험 설치^4,18뿐만 아니라 시간 및 사용할 수 있는 도구에 따라 달라 집니다.

내 막 로드와 부 량 변화에 대 한 수정 하는 TPS를 사용 하 여, 그것을 다른 세포 막, 대규모 단백질 표정 분석을 수행 하는 경우에 특히 사이 샘플을 비교할 필요할 수 있습니다. 그러나, 항 체 바인딩 효율성과 총 단백질 얼룩 강도 같은 요인에서 변화를 소개 추가 별도 젤에 분석 단백질 견본 및 막 사이 변화 합니다. 이 상황에서 강력한 정량화에 대 한 그것은 멤브레인 사이 가변성을 더 정규화 단계를 소개 하는 데 필요한 따라서. 이 실험에서 일정 하 게 유지는 별도로 분석 된 막의 각각에 내부 로드 표준 포함 하 여 달성 될 수 있다. 이 표준은 모든 단백질을 실험에 포함 하는 모든 세포 막에 걸쳐 사용 될 충분 한 수량에 얻어질 수 있다 lysate의 형태를 걸릴 수 있습니다. 여기, 우리 두뇌는 즉시 무 균 하 고 높은 농도에 단백질의 상당한 금액을 포함 하는 취득된 단백질 lysate lysate 쥐의 뇌 (5 일 오래 된 컨트롤 마우스에서 얻은)의 사용 합니다. 3 중에는 내부 표준 로드 정상화 하 고 직접 비교를 별도 세포 막에 샘플 수 있습니다.

여기, 우리는 우리가 다른 조직, (를 포함 하 여 질병 모델), 마우스 모델 및 발달 timepoints¹⁹단백질 식 변화의 복잡 한 비교를 수행 하기 위해 수 있도록 개발 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 결합 하 여 형광 TPS는 내부 로드 표준의 사용과, 우리 수 샘플 및 단일 실험에서 비교 될 수 있는 실험 조건에서에서 기존의 한계를 극복할 수 있었다. 이 방법은 전통적인 서쪽 오 점 기법, 수 있도록 더 나은 다른 조직 및 샘플 단백질 식이 탐구 하는 연구자의 사용을 확장 합니다.