Western blotting to technika, która jest powszechnie używana do wykrywania i ilościowego określania ekspresji białek, w tym w homogenatach tkanek lub ekstraktach. Z biegiem lat technika ta doprowadziła do wielu postępów zarówno w badaniach podstawowych, jak i klinicznych, gdzie może być używana jako narzędzie diagnostyczne do identyfikacji obecności choroby¹^,². Western blotting został po raz pierwszy opisany w 1979 roku jako metoda przenoszenia białek z żeli poliakrylamidowych na arkusze nitrocelulozy, a następnie wizualizacji białek za pomocą przeciwciał drugorzędowych, które były albo znakowane radioaktywnie, albo sprzężone z fluoresceiną lub peroksydazą³. Dzięki rozwojowi dostępnych na rynku zestawów i urządzeń, zachodnie metody blottingu były z biegiem lat coraz bardziej standaryzowane i upraszczane. Rzeczywiście, technika ta jest obecnie chętnie stosowana przez naukowców o różnym pochodzeniu i poziomie doświadczenia. Jednak, podobnie jak w przypadku wielu podobnych technik eksperymentalnych, na wynik analiz Western blot łatwo wpływają wybory dokonane podczas projektowania i realizacji eksperymentu. Dlatego ważne jest, aby dostępność ustandaryzowanych metod Western blot nie przesłaniała potrzeby starannego planowania i projektowania eksperymentów. Rozważania eksperymentalne obejmują między innymi przygotowanie i obsługę próbek, wybór i walidację przeciwciał do wykrywania białek oraz efektywność transferu żel-błona szczególnie małych lub dużych (<10 lub >140 kDa) białek⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Jakość białka w oryginalnej próbce odgrywa znaczącą rolę w określaniu wyniku późniejszej analizy Western blot. Ponieważ białko można ekstrahować z wielu różnych próbek i źródeł, w tym z linii komórkowych, tkanek z modeli zwierzęcych i pośmiertnych tkanek ludzkich, w celu uzyskania powtarzalnych wyników wymagana jest konsekwencja w obchodzeniu się i przetwarzaniu. Na przykład, gdy wymagane jest długotrwałe przechowywanie próbek do ekstrakcji białka, ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że chociaż białko jest ogólnie stabilne w temperaturze -80 °C, odnotowano różnice w stabilności białka między wyekstrahowanymi białkami a nienaruszonymi tkankami w temperaturze -80 °C¹⁰. Ponadto, aby uzyskać powtarzalne szacunki ilości białka, kluczowa jest konsekwentna homogenizacja próbek. Optymalizacja różnych do lizy i metod homogenizacji (np. homogenizacja ręczna w porównaniu z metodami automatycznymi) może być wymagana przed rozpoczęciem eksperymentu ilościowego na dużą skalę.

Strategie normalizacji korygujące obciążenie białkami i zmienność kwantyfikacyjną są niezbędne do uzyskania solidnych, ilościowych wyników ekspresji białek. Białka porządkowe, takie jak β-aktyna, α-tubulina, β-tubulina i dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa (GAPDH) były tradycyjnie stosowane do normalizacji poziomu białka w celu oceny ilościowej. Jednak w ciągu ostatnich kilku lat coraz częściej krytykowano normalizację do określonych białek porządkowych w celu oceny ilościowej¹¹^,¹². Na przykład ekspresja białek porządkowych może się zmieniać na różnych etapach rozwoju¹³^,¹⁴, w tkankach tego samego zwierzęcia⁴ i w różnych stanach chorobowych⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. W związku z tym stosowanie specyficznych białek porządkowych ogranicza możliwości dokonywania bardziej złożonych porównań między ekspresją białek z różnych tkanek, w różnych punktach czasowych i w różnych warunkach eksperymentalnych. Alternatywą dla białek porządkowych w celu kontrolowania zmienności obciążenia białkami jest użycie całkowitego barwienia białka (TPS), które znakuje i wizualizuje wszystkie białka obecne w próbce. TPS umożliwia normalizację sygnału w oparciu o całkowite obciążenie białkiem, a nie poziomy jednego konkretnego białka, a zatem kwantyfikacja sygnału TPS powinna być porównywalna i odtwarzalna niezależnie od warunków eksperymentalnych, typu próbki lub punktu czasowego rozwoju. Przykłady barwienia białka całkowitego obejmują Ponceau S, żele bez barwników, Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black i Cy5 (przegląd w odnośniku 18). Każda z tych metod ma określone zalety i ograniczenia, a wybór metody zależy od dostępnego czasu i narzędzi, a także konfiguracji eksperymentalnej⁴^,¹⁸.

Oprócz używania TPS do korygowania obciążenia wewnątrz błony i zmienności ilościowej, może być konieczne porównywanie próbek między różnymi membranami, szczególnie podczas przeprowadzania analizy ekspresji białek na dużą skalę. Jednak zmienność czynników, takich jak skuteczność wiązania przeciwciał i całkowita intensywność barwienia białek, może wprowadzać dalszą zmienność między próbkami białek, które są analizowane na oddzielnych żelach i błonach. W celu uzyskania solidnej oceny ilościowej w tej sytuacji konieczne jest zatem wprowadzenie kolejnego etapu normalizacji w celu uwzględnienia zmienności między błonami. Można to osiągnąć poprzez włączenie wewnętrznego wzorca obciążenia na każdej z oddzielnie analizowanych membran, który jest utrzymywany na stałym poziomie we wszystkich eksperymentach. Wzorzec ten może mieć postać dowolnego lizatu białkowego, który można uzyskać w ilościach wystarczających do wykorzystania na wszystkich błonach objętych eksperymentem. Tutaj używamy lizatu mózgu myszy (uzyskanego od 5-dniowych myszy kontrolnych), ponieważ mózg łatwo się homogenizuje, a uzyskany lizat białkowy zawiera znaczną ilość białka w wysokim stężeniu. Umieszczenie wzorca wewnętrznego w trzech egzemplarzach umożliwia normalizację i bezpośrednie porównanie próbek na oddzielnych membranach.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół, który opracowaliśmy, aby umożliwić nam przeprowadzenie kompleksowych porównań zmienności ekspresji białek w różnych tkankach, modelach mysich (w tym modelach chorób) i punktach czasowych rozwoju¹⁹. Łącząc fluorescencyjny TPS z wykorzystaniem wewnętrznego wzorca obciążenia, byliśmy w stanie przezwyciężyć istniejące ograniczenia w liczbie próbek i warunkach eksperymentalnych, które można porównać w ramach jednego eksperymentu. Podejście to rozszerza zastosowanie tradycyjnych technik Western blot, umożliwiając w ten sposób naukowcom lepsze badanie ekspresji białek w różnych tkankach i próbkach.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting