Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting
Chapters
Summary April 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denna metod beskriver en robust och reproducerbar metod för jämförelse av proteinnivåer i olika vävnader och vid olika utvecklande tidpunkter med hjälp av standardiserade kvantitativa western blotting tillvägagångssättet.
Transcript
Detta protokoll kan användas för att ta itu med viktiga frågor i grundläggande och klinisk forskning genom att titta på proteinuttryck över olika vävnader och tidspunkter. För att utföra pålitlig kvantitativ Västerländsk blotting kombinerar vi en fluorescerande total proteinfläck med en intern lastningskontroll. Detta övervinner begränsningar som uppstår när man jämför olika vävnader över experimentella förhållanden.
För att extrahera proteiner från snapinfrysta cell- eller vävnadsprover tina minus-80-gradersproven på is innan man tvättar proverna i förekommande fall, enligt tabellen. Med hjälp av en handhållen elektrisk homogenisator med en polypropylen mortelstöt, homogenisera de tvättade proverna, skölja mortelstöten i dubbeldestillerat vatten och torkning med en ren vävnad mellan proverna. Låt proverna vara kvar på is i 10 minuter, följt av centrifugering.
Sedan överför du protein-provhaltig supernatant till ett nytt rör på is utan att störa pelleten. För kvantifiering av proteinkoncentrationen, inrätta bovint serumalbumin standarder vid ökande koncentrationer i tre exemplar, och tillsätt en mikroliter av varje proteinprov i duplikat till lämpliga brunnar av en 96-väl optisk platta. Inkubera proteinet på ett 60-graders-Celsius-värmeblock i 10 minuter eller längre om proteinkoncentrationen förväntas vara låg och mäta absorptionen vid 560 nanometer på en tallriksläsare.
Exportera plattläsarmätningarna och beräkna proteinkoncentrationen genom att jämföra de genomsnittliga absorbansvärdena för varje prov med en standardkurva som erhålls med hjälp av proteinstandarden. För att normalisera mängden protein, förbered spädningar av proteinproverna i provbuffert och ultrarent vatten och inkubera proverna i ett 70-graders-Celsius-värmeblock i 10 minuter. Placera sedan proverna på is innan du virvlar och kort centrifugerar.
För elektrofores, inrätta en precast fyra till 12%Bis-Tris gradient gel i gelen elektrofores kammare systemet och ladda 3,5 mikroliter av ett protein standard i brunnen. Vid användning av en intern standard för mellan-membrannormalisering, ladda en mängd som är lika med de andra proverna i de tre första brunnarna bredvid proteinstegen och ladda 30 mikrogram av varje prov i de återstående brunnarna. Kör sedan proverna genom staplingsgelen på 80 volt i 10 minuter följt av 150 volt i ytterligare 45 till 60 minuter.
I slutet av elektrofores, för att montera överföring stacken, placera protein gel på botten stacken innehåller polyvinyliden difluorid membran följt av filterpapper. Använd blottingrullen för att ta bort eventuella luftbubblor och placera den övre bunten på ovansidan av filterpapperet innan du rullar bunten igen för att ta bort luftbubblor. Överför hela stacken i överföringsanordningen med elektroden på enhetens vänstra sida och placera gelsvampen ovanpå bunten så att svampen är i linje med motsvarande elektriska kontakter på enheten.
Efter stängning av locket, välj och starta lämpligt program. I slutet av programmet, skär membranet till gelstorleken och tvätta skärmembranet snabbt med dubbeldestillerat vatten innan du fortsätter med den totala proteinfläcken. För total proteinfärgning rullar du in membranet i ett 50-milliliterrör med proteinsidan vänd inåt och märker membranet med fem milliliter proteinfläckslösning på en rulle i fem minuter vid rumstemperatur i en rökhuva.
I slutet av inkubationen, tvätta membranet snabbt med fem milliliter av tvättlösning, återföra röret kort till rullen mellan tvättarna, följt av en kort sköljning med ultrarent vatten. Tillsätt tre milliliter blockerande buffert till membranet och återföra membranet till valsen i 30 minuter vid rumstemperatur. Ersätt den blockerande bufferten med den primära antikroppen av intresse vid lämplig optimerad koncentration och inkubera membranet på valsen över natten vid fyra grader Celsius.
Nästa dag, tvätta membranet sex gånger i fem minuter med fem milliliter färsk PBS per tvätt på rullen vid rumstemperatur. Efter den sista tvätten inkuberas membranet med lämplig sekundär antikroppslösning på rullen under en timme vid rumstemperatur följt av tre tvättar i 30 minuter per tvätt. Efter den sista tvätten, torka membranet och använd aluminiumfolie för att hålla membranet skyddat från ljus.
För bildanskaffning, placera membranet på skannern med proteinsidan vänd nedåt och välj skanningsområdet i programvaran. Sedan, skaffa bilder i båda kanalerna och exportera bilderna till en lämplig bild analysprogram. Visa 700-nanometerkanalen för att visa det totala proteinfärgningsresultatet och Välj analys och Rita rektangel för att definiera området av intresse för normalisering.
Sedan kopierar och klistrar du in det första rektangelområdet på varje enskilt prov för att säkerställa att den definierade regionen har samma storlek för alla de analyserade körfälten. För att kvantifiera proteinkoncentrationen i varje körfält kopierar du resultaten från både den totala proteinfläcken och proteinet av intresse för ett kalkylprogram och bestämmer den högsta totala proteinfläckssignalen. Sedan, dela varje totalt protein fläck signal värde med detta värde för att erhålla det normaliserade proteinet lastning värde och dela upp 800-nanometer signalvärdet från varje enskilt prov genom dess motsvarande normaliserade protein värde för att beräkna det relativa proteinet uttryck förhållandet i olika prover.
I dessa representativa västerländska blots jämförs proteiner som utvinns ur vävnader som erhållits från postnatal dag fem möss med proteiner som utvinns från 10 veckor gamla vuxna möss. Kvantifiering av fluorescensintensiteten hos den totala proteinfläcken uppnåddes genom att fluorescensintensiteten mättes inuti rektangelrutan på varje körfält. När hela körfält analyseras förblir fluorescensintensiteten relativt lik mellan prover, vilket indikerar att det är lämpligt för detta ändamål att använda den totala proteinfläcken för normalisering.
Den fluorescerande totala proteinfläcken kan också användas för att jämföra proteinnivåer vid olika utvecklingstidspunkter. Till exempel, även om överlevnad motor neuron proteinnivåer klart minska med åldern hos möss, det totala proteinet färgade kvantifiering förblir konstant. Användningen av interna standarder, fluorescensbaserad normalisering och adekvat statistik ökar robustheten hos komplex proteinuttrycksanalys över olika förhållanden.
Detta protokoll lägger till traditionella västerländska blot tekniker, övervinna frågorna om lämpliga lastning kontroller och jämförelser över experimentella partier, och ger flexibilitet för protein uttryck analys. Detta tillvägagångssätt kan utvidgas till att jämföra proteinuttryck under andra experimentella förhållanden.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
