Neuroscience
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신경교 세포와 신경 세포의 3D 재건 및 가상 현실 분석을위한 방법
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Summary September 28th, 2019
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설명된 파이프라인은 기가바이트보다 큰 전자 현미경 데이터 세트를 세분화하여 전체 세포 형태를 추출하도록 설계되었습니다. 셀을 3D로 재구성하면 개별 요구를 중심으로 설계된 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 3D로 직접 정성적 및 정량적 분석을 수행할 수 있으며 가상 현실을 사용하여 뷰 오클루전을 극복할 수도 있습니다.
Transcript
자동 직렬 단면도 전자 현미경 기술. 생물학적 3차원 모델 이미지 처리의 생성으로 이어지는 파이프라인의 속도 제한 단계. 당사의 프로토콜은 단 며칠 만에 이미지 볼륨의 밀도 가늘게 구축되는 것을 생성하기 위한 단계별 지침을 제공합니다.
3차원 모델을 사용하여 정량적 측정을 위한 접근 방식과 결합됩니다. 이 기술을 통해 뇌 를 제외한 조직의 3D 구조는 잠재적으로 특정 질병의 전형적인 구조적 손상을 식별하고 진단 전략을 개선하기 위해 분석 될 수 있습니다. 세분화는 지루한 단계입니다.
잘못된 세분화를 교정하고 전체 프로세스를 다시 시작해야 하는 것을 피하기 위해 가능한 한 정확하게 만들수 있습니다. 소프트웨어의 디자인은 때때로 매우 사용자 친화적이지 않습니다. 따라서 세분화에 대한 시작 작업을 보는 것이 중요합니다.
스택이 포함된 현미경에서 네이티브 파일을 드래그하고 떨어뜨리거나 스택이 열리면 스택이 이미지, 속성으로 이동하면 전체 이미지 스택을 포함하는 폴더를 소프트웨어 창으로 드래그하고 떨어뜨리면 이미지 스택크기를 메타데이터에서 읽음으로써 이미지 스택을 엽니다. 이미지를 클릭하여 이미지를 8비트로 변환하고 8비트를 선택합니다. 원래 스택이 다른 타일로 획득되면 TrakEM2 내에서 스티치를 적용합니다.
필요한 경우 TrakEM2 임베디드 함수 세그먼트 구조를 사용하여 새로운 TrakEM2 프로젝트를 만듭니다. TrakEM2의 끈적끈적한 경우 템플릿 창 아래에 있는 모든 것을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 새 자식 영역 목록 '드래그 앤 드롭'을 프로젝트 개체 아래에 폴더에 추가하면 프로젝트 개체 아래에 있으면 무엇이든 표시됩니다. 템플릿에서 프로젝트 개체 아래에 있는 모든 영역 목록 '이미지 스택 뷰포트에서 커서가 있는 Z-space'를 선택합니다.
영역 목록'은 고유 ID 번호와 함께 표시됩니다. 상단의 브러시 도구를 선택하고 마우스를 사용하여 전체 Z 스택에 사이토솔을 채우면 구조를 분할합니다. 조각용 시드로 Ilastik에서 사용할 분할 된 질량을 내보냅니다.
이렇게 하려면 Z-space 목록의 영역 목록 개체 또는 뷰 포트의 마스크에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 내보내기'영역 목록을 레이블 T-I-F로 선택합니다. 추가 재구성에 필요한 해상도에 따라 다운 샘플링을 통해 이미지 스택의 픽셀 크기를 줄입니다. 세분화 및 재구성에 사용할 소프트웨어의 메모리 요구 사항을 고려합니다.
Ilastik은 X-Y에서 최대 500픽셀의 스택을 처리합니다. 개체가 여전히 인식할 수 있는 최소 크기를 고려하여 분할할 수 있습니다. 이미지의 크기 조정'을 사용하여 대비를 향상시키고 세분화를 돕기 위해 날카로운 마스크 필터를 적용하여 멤브레인을 선명하게 만들 수 있습니다.
프로세스'필터의 날카로운 질량'은 파일 '이미지 시퀀스로 저장'을 사용하여 세분화 소프트웨어에서 추가 처리를 위해 이미지 스택을 단일 이미지로 내보내고 TIFF 형식을 선택합니다. 메인 Ilastik 끈적거림에서 조각 모듈을 선택합니다. 이미지 스택을 로드하고 시퀀스 '전체 디렉터리 선택'에서 단일 3D/4D 볼륨을 추가하고 이미지 로드 옵션이 있는 새 창 하단에 단일 파일로 저장된 이미지 스택이 포함된 폴더를 선택하여 Z"를 선택하도록 합니다.
다음 단계의 경우 모든 작업 및 버튼은 메인 소프트웨어 끈적끈적한 왼쪽에 있습니다. 사전 처리 탭에서 이미 확인된 표준 옵션을 사용합니다. 밝은 선의 풍부한 필터를 사용하고 필터 스케일을 1.600으로 유지합니다.
이 둘레는 나중에 수정할 수 있습니다. 사전 처리가 완료되면 레이블링 모듈의 드롭다운 메뉴에서 다음 페이지를 선택합니다. 기본적으로 하나의 개체와 하나의 배경이 있습니다.
객체 시드를 클릭하여 선택하고 관심 구조 위에 선을 그립니다. 그런 다음 백그라운드 시드를 선택하고 재구성할 오브젝트 외부에 하나 또는 여러 선을 그립니다. 이제 세그먼트를 클릭하고 기다립니다.
컴퓨터의 전원과 스택 크기에 따라 세분화가 몇 초에서 몇 시간까지 걸릴 수 있습니다. 작업이 완료되면 분할을 강조 표시하는 반투명 마스크가 분할된 구조 위에 표시되어야 합니다. 스택을 스크롤하여 세분화를 확인합니다.
세분화는 관심 구조를 따르지 않거나 그것에서 유출되지 않는 경우 정확하지 않을 수 있습니다. 유출된 세분화에 배경 시드를 배치하여 유출된 모든 유출을 수정합니다. 그리고 관심 있는 개체의 재구성되지 않은 세그먼트 위에 개체 시드를 추가합니다.
Ilastik을 사용하여 세분화를 정확하게 시각적으로 교정하는 것은 지루할 수 있지만 내보낸 개체에 아티팩트가 포함되어 있지 않도록 하는 것이 중요합니다. 세분화가 아직 올바르지 않은 경우 허용되지 않는 분류 픽셀의 양을 늘리거나 줄이는 바이어스 매개변수로 수정해 보십시오. 기본적으로 값은 0.95입니다.
세분화가 너무 보수적인 경우 유출을 제한하거나 증가하도록 줄입니다. 또 다른 가능성은 전처리를 클릭하고 필터의 크기를 수정하는 것입니다. 값을 높이면 소금과 후추 잡음과 같은 효과가 최소화되지만 멤브레인이 더 흐릿해지고 세부 사항이 더 작아 감지하기가 더 어려워집니다.
이렇게 하면 유출이 제한될 수 있습니다. 원하는 모든 객체가 분할된 한 필요에 따라 반복합니다. 개체가 완료되면 세그먼트로 이동하여 현재 개체를 저장'두 개의 새 시드가 새 개체의 세분화를 시작하는 것처럼 보입니다.
추상 표면은 모든 메시를 내보내기를 클릭하여 O-B-J 파일로 바로 측정합니다'TrakEM2 내에서 수동으로 분할된 모델을 3D로 시각화한 다음, 3D'A 더 높은 값으로 표시를 선택하면 해상도가 낮은 메시가 생성됩니다. 마지막으로, 3D 메쉬를 웨이브프론트 O-B-J로 내보내 메뉴 파일의 내보내기 표면 'WaveFront'에서 선택하여 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 신경 모프 툴 키트를 설치한 후 오픈 블렌더를 엽니다. 장면 메뉴 아래에 가져오기 개체를 클릭하여 신경 모프 배치 가져오기를 사용하여 개체를 가져와 여러 개체를 한 번에 가져옵니다.
활성화하고, 다시 메시를 사용하고, 매끄러운 감속을 사용해야 합니다. 아웃 라이너에서 관심 있는 개체를 선택하고 수정자의 메뉴에서 다시 메시 함수의 Octree 깊이를 수정합니다. 정점 수를 최소화하고 해상도 및 올바른 형태에서 세부 정보를 잃지 않도록 반복적으로 작동합니다.
Octree 깊이를 변경할 때 메인 끈적 거리의 메시가 그에 따라 변경됩니다. 작업이 완료되면 신청을 클릭하여 프로세스를 완료합니다. 왼쪽 패널의 신경 모프 메뉴로 이동하여 이미지 중첩 도구 이미지 스택 상호 작용을 사용하여 이미지 스택을 로드합니다.
X, Y 및 Z에 대한 이미지 스택의 물리적 크기를 입력하고 소스 Z.X및 Y가 직교 평면인 경우를 클릭하여 스택의 경로를 선택해야 합니다. 선택 사항이며 사용자가 유효한 경로를 삽입하는 경우에만 로드됩니다. 그런 다음 뷰 포트에서 메시를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 선택합니다.
탭을 눌러 편집 모드를 입력하고 마우스 마우스 오른쪽 단추를 사용하여 하나 이상의 정점을 선택하고 마지막으로 정점에서 이미지 표시를 클릭합니다. 마이크로그래프가 있는 하나 이상의 절단 평면이 메시 위에 겹쳐진 것처럼 보입니다. 오른쪽 단추를 클릭하여 절단 평면을 선택합니다.
그런 다음 제어 Y를 누르고 마우스 스크롤을 사용하여 3D 모델을 스크롤합니다. 이것은 교정 방법으로도 사용할 수 있습니다. 여기에 TrakEM2 및 Ilastik을 사용하여 세분화 및 재구성이 표시됩니다.
TrakEM2 구이는 수동으로 빨간색으로 분할된 오브젝트와 함께 표시됩니다. 그런 다음 내보낸 마스크는 반자동 세분화를 위한 입력으로 사용할 수 있습니다. Ilastik에서 마스크는 수동 교정을 위해 TrakEM2로 더 내보낼 수 있습니다.
마스크는 3D 삼각형 메시로 내보내 재구성된 구조를 나타낼 수 있습니다. 이 예에서는, 4개의 신경세포, 성상세포, microglia 및 pericytes는 이 과정을 사용하여 재구성되었습니다. 사용자 지정 도구를 사용하여 재구성된 형태에 대한 3D 분석이 표시됩니다.
다음은 전자 현미경 데이터 세트를 스캔하는 집중된 이온 빔으로부터의 등위축 영상 부피입니다. 이 데이터의 조밀한 재구성은 축축, 성상 세포 과정 및 점생을 보여줍니다. 이 현미경 사진은 시냅스 및 성상세포 글리코겐 과립과 같은 정량화를 위한 표적의 예를 보여줍니다.
그 현미경 사진에서 마스크는 시냅스 주위에 글리코겐 과립의 분포를 보여줍니다. 여기에 글리코겐 유래 젖산 흡수 모델 또는 GLAM'Here의 그래픽 시각화의 입력 및 출력의 그래픽 일러스트레이션이 도시되어, 사용자는 집중된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 데이터 세트에서 조밀한 재구성작업을 하는 동안 가상 현실 또는 V-R 헤드셋을 착용하고 있는 것으로 나타났다. 중성염의 하위 집합에서 몰입형 V-R 장면을 관찰할 수 있습니다.
녹색 레이저는 GLAM의 피크를 가리키고 있다. 내보낸 3D 개체의 정확한 크기를 결정하고 측정이 실제 크기를 반영한다고 판단하기 때문에 주요 중요합니다. 직렬 섹션 이미징, 이미징 세분화 및 3D 구조의 개념은 상당히 오래되었습니다.
기술적 가속을 발견하는 것은 해부학 교과서의 검토에 colectomies의 발전으로 이끌어 냅니다. 전자 현미경 검사법의 뇌 연구를 위해 개발되었지만, 데이터를 생성하는 현미경 기술도 일반화될 수 있으며, 모든 종류의 3D 이미징 기술은 이러한 이미징 세분화 및 시공 기술의 혜택을 누릴 수 있다. C-T 스캔 및 M-R-I를 포함합니다.
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