Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Utvärdering av Synaptic Multiplicity använder hela-cell Patch-clamp elektrofysiologi
Chapters
Summary April 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma funktionella synaptic multiplicityen använder hela-cell patch clamp elektrofysiologi i akut hjärnskada skivor.
Transcript
I hjärnan bildar ett par nervceller ofta flera synaptiska kontakter, som kallas synaptisk multiplicity. Men, exakt undersökning av synaptisk multiplicity kräver tekniskt utmanande experiment. Detta protokoll beskriver en enkel metod för brutto uppskattning av synaptisk multiplicity med hela-cell patch-clamp elektrofysiologi.
Denna metod kan tillämpas på alla arter och hjärnan område för att undersöka synaptisk multiplicity. Denna metod kräver grundläggande färdigheter i hela-cell patch-clamp elektrofysiologi. Att få inspelningar av hög kvalitet med lågt och stabilt åtkomstmotstånd är avgörande för att data ska kunna tolkas korrekt.
För att erhålla helcellskonfiguration placerar du inspelningspipetten precis ovanför skiva och offsetpipettström i spänningsklämningsläget. Applicera lätt positivt tryck på pipetten, och lås stopcock. Därefter väljer du en frisk cell med ett intakt membran, och närmar dig vävnaden med pipetten.
Det positiva trycket bör orsaka en lätt störning på vävnaden. Ta långsamt pipetten närmare cellen i en diagonal rörelse tills en liten grop bildas på cellytan. Släpp sedan det positiva trycklåset.
Cellen kommer att börja bilda en tätning, och motståndet kommer att öka över en gigaohm. I spänningsklämma håller du cellen på minus 68 millivolt. Därefter dra något pipetten bort från cellen diagonalt för att avlägsna övertryck.
Kompensera för den snabba och långsamma pipettkaacitansen. Applicera en kort uppsugning genom röret som är anslutet till pipetthållaren för att bryta igenom cellen och få en helcellskonfiguration. Sedan, växla till cellläge på membranet testfönstret i en elektrofysiologi datainsamling och analys programvara.
Bibehåll temperaturen i inspelningsbadet vid 27 till 30 grader Celsius och flödet på 1,5 till två milliliter per minut för efterföljande experiment. I en multiplikitet synaps, en åtgärd potential synkroniserar signalsubstansen release och genererar en större postsynaptic ström. Blockera åtgärder potential och kalcium-beroende vesicular release med TTX och kadmium förhindrar den postynaptic ström summering och minskar amplituden.
När det inte finns någon multiplicity kommer blockeringsåtgärdspotential inte att ändra amplituden. I experiment ett, för att uppskatta multiplicitet, håll cellen på minus 68 millivolt medan perfusing det med låg kalcium aCSF. Registrera de spontana EPSC:erna i minst fem minuter för att säkerställa en stabil baslinje.
Därefter lägger du till 30 mikromolarer 4-AP till aCSF för att öka åtgärder potentialberoende händelser, och spela in spontana EPSCs i minst 10 minuter för att få full läkemedelseffekt. Lägg sedan till 0,5 mikromolarer TTX och 10 mikromolarer kadmium till aCSF med 4-AP, och spela in miniatyr EPSCs i minst 10 minuter. För offlineanalys, använd den sista minuten av baslinjen omedelbart före tillämpningen av 4-AP, den 10: e minuten av 4-AP-program och den 10: e minuten av TTX-tillämpning.
I detta experiment ersätts extracellulärt kalcium med strontium för att desynkronisera frisättningen av synaptiska vesiklar. Därför, om multiplikitet är närvarande, bör detta minska amplituden av postsynaptiska strömmar. I experiment två, spela in spontana EPSCs i minst fem minuter medan perfusing cellen med normal kalcium aCSF.
För att desynkronisera vesicle release, börja perfusing cellen med strontium aCSF och spela in spontana EPSCs. För offline-analys, för att avgöra om de stora amplitud spontana EPSC beror på den synkrona frisättningen av vesiklar, jämför sista minuten av baslinjen till den 10: e minuten av strontium aCSF ansökan. Multiplicitet kan innebära multivesicular frisättning, vilket orsakar högre signalsubstanskoncentration i synaptiska spalten.
Tillägg av gamma-DGG, en låg-affinitet AMPA-receptorantagonist, leder till mindre effektiv hämning av större multiquantal jämfört med mindre uniquantal postynaptic strömmar. Utan multivesicular release, kommer gamma-DGG vara lika effektiva på större och mindre postsynaptic strömmar. I experiment tre, för att testa för multivesicular release, spela in spontana EPSCs i låg kalcium aCSF i minst fem minuter.
Lägg till 30 mikromolarer 4-AP till aCSF genom perfusionssystemet. Spela in de spontana EPSC:erna i minst 10 minuter. Lägg sedan till 200 mikromolarer gamma-DGG till aCSF med 4-AP, och spela in de spontana EPSC:erna i minst 10 minuter.
Som ett kontrollexperiment i en separat cell, upprepa procedurerna, men applicera en låg koncentration av DNQX istället för gamma-DGG. För offlineanalys, analysera sista minuten av varje läkemedelsapplikation. Skurar av synaptisk aktivitet kan transiently öka spontana åtgärder potentiella bränning och frisättning sannolikheten för de stimulerade afferents.
Om nervceller uppvisar multiplicitet, bör ökningen av åtgärder potentialer orsaka en övergående ökning av amplituden av postsynaptiska strömmar. I experiment fyra, registrera spontana EPSCs i normala kalcium aCSF. För att öka åtgärder potentiella bränning, stimulera afferents med hjälp av en monopolär glaselektrod fylld med aCSF med en hastighet av 20 hertz i två sekunder, och upprepa 10 gånger med en inter-burst intervall på 20 sekunder.
För analys, använd 5, 000 millisekunder spontana EPSCs före den första stimulans som baslinjen och jämföra med de 10 till 300 millisekunder spontana EPSCs efter den slutliga stimulans. Sedan, ta den genomsnittliga amplituden och frekvensen förändras över 10 prövningar. Analysera spontana EPSCs och miniatyr EPSCs med hjälp av ett program som upptäcker och analyserar synaptiska strömmar.
Använd de föreslagna detektionsparametrarna och nonstop-analysfunktionen för att upptäcka AMPA-receptormedierade EPSC:er. Manuellt skanna varje inspelning för att säkerställa att programmet är korrekt upptäcka varje händelse. Exportera händelsedata genom att kopiera den till urklipp, och klistra in dem i en programvara för datahantering.
Därefter beräkna den genomsnittliga frekvensen och amplituden för varje läkemedelsbehandling, och utför de relevanta statistiska analyserna. I ett exempel som visas här ökar 4-AP både amplituden och frekvensen av spontana EPSC. Efterföljande applicering av TTX och kadmium minskar både amplituden och frekvensen.
Här är fördelningen av spontan EPSC amplitud från inspelningen. I de hypotalamic nervcellerna som undersöks här, amplituden och frekvensen av baslinjen och TTX villkor är desamma, vilket tyder på att baslinjen spontana EPSCs innehåller mycket få åtgärder potential-beroende EPSCs. Följaktligen kan efterföljande experiment jämföra skillnaden mellan baslinjen och 4-AP för att mäta multiplicitet.
Styrkan av synaptic överföring kan transiently ökas av skurar av synaptisk aktivitet. För att undersöka multiplicitet under mer fysiologiska förhållanden, afferent stimulering kan användas för att öka åtgärder potentiella bränning och frisättning sannolikhet. Här är sammanfattningarna av spontana EPSC frekvens och amplitud förändringar efter synaptisk stimulering.
Stabila inspelningar är väsentliga för korrekt tolkning av uppgifterna. Beskriv data om åtkomstmotståndet ändras med mer än 20 %under inspelningen, eftersom detta kan förvirra analysen. Detta protokoll erbjuder ett enkelt sätt att uppskatta synaptisk multiplicity, som är en viktig avgörande faktor för synaptisk effekt och dess plasticitet i olika fysiologiska och patofysiologiska tillstånd.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
