Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In vivo direkte omprogrammering af residente Gliale celler til Interneuroner ved intracerebral injektion af virale vektorer
Chapters
Summary June 17th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol har til formål at generere direkte omprogrammeret interneuroner in vivo, ved hjælp af et AAV-baseret viral system i hjernen og en FLEX synapsin-drevet GFP reporter, som giver mulighed for celle identifikation og yderligere analyse in vivo.
Transcript
Denne protokol viser, at det er muligt at generere nye neuroner direkte i hjernen fra hjemmehørende glia, og at disse omprogrammerede celler modnes til subtype-specifikke neuroner. Den største fordel er den cre-afhængige AAV-virus, der muliggør specifik målretning af NG2-glia og GFP reporter, der mærker omprogrammerede neuroner til analyse. Generering af nye neuroner i hjernen kan føre til fremtidig udvikling for celleerstatningsbehandlinger i hjernen.
I vores protokol genererer vi parvalbumin-positive interneuroner, der har konsekvenser for psykiatriske lidelser. In vivo omprogrammering kan anvendes på andre hjerneområder og kredsløb afhængigt af, hvad neuronal fænotype og neurologisk tilstand, du ønsker at målrette. Demonstration af proceduren vil være Jenny Johansson: en tekniker, Maria Pereira: en tidligere ph.d.-studerende, og Marcella Birtele: en ph.d.-studerende i vores laboratorium.
For at producere AAV5 viral vektor, frø HEK293T celler med standard kultur medium i fem T175 kolber. Når cellerne når op på 50 til 70% sammenløb, forberedes følgende blanding til transvection. I en 50 milliliter centrifuge rør, tilsæt lige kindtand mængder af vektor plasmid, og pDG serie hjælper plasmid.
Tilføj Tris-EDTA buffer til et endeligt volumen på 144 mikroliter derefter tilføje ultrapure vand til at resultere i et samlet volumen på 1296 mikroliter og mix. Dernæst tilsættes 144 mikroliter af 2,5 molar calciumchlorid og bland. Derefter tilsættes 1,92 milliliter HBS til DNA-opløsningen og vortex med det samme.
Inkuber ved stuetemperatur i præcis 60 sekunder. Derefter overføres opløsningen til 28 milliliter frisk cellekulturmedium og blandes. Mediet i kolben erstattes med det medium, der indeholder transvection-blandingen.
Vent i tre dage, og overfør medierne til spilde. Der tilsættes fem milliliter høstbuffer til hver kolbe, hvortil der tilsættes yderligere fire milliliter DPBS til hver kolbe for at skylle de resterende celler og samle med celleopløsningen. Centrifuge de høstede celler ved 1, 000 x g i fem minutter ved fire grader Celsius.
Efter centrifugering fjernes supernatanten og pelleten opløses i 15 milliliter lysisbuffer. Fryse 50 milliliter centrifugerør på tøris i 15 minutter og opbevares i et minus 20 grader Celsius fryser. Før brug optø den høstede celle lysat i et vandbad ved 37 grader Celsius.
I denne procedure udføres AAV-rensning ved iodixanol gradient ultracentrifugering, og der anvendes ultracentrifugeloftrør med centrifugering ved 350, 000 x g i en time og 45 minutter ved stuetemperatur. For at udtrække AAV-holdstoffasen indsættes en 10 millilitersprøjte med en 18 gauge-nål på omkring to millimeter under 40 til 60%-fasegrænsen med facetten opad og trækkes tilbage. Sørg for at stoppe, før du når proteinbåndet efter fem til seks milliliter af den virale vektor er blevet ekstraheret.
Derefter rense og koncentrere den fortyndede iodixanol gradient gennem en anion udveksling filter, ved at skubbe den igennem med en hastighed ikke hurtigere end en dråbe per sekund. Tryk derefter tre milliliter IE-buffer langsomt gennem filteret for at vaske det. Dernæst eluter blandingen i en centrifugalfilterenhed med en til to milliliter elueringsbuffer.
Tilføj DPBS til enheden til et endeligt volumen på fire milliliter. Centrifuge ved 2,000 x g ved stuetemperatur, indtil der er mindre end 0,5 milliliter DPBS tilbage i filteret. Derefter fjernes væsken fra bunden af røret, genopfyldes med fire milliliter DPBS og centrifuge igen.
Gentag dette trin to gange mere, skal du sørge for, at mængden af koncentreret vektor på filteret er omkring 200 mikroliter efter den sidste centrifugering. Fjern den 200 mikroliter koncentrerede vektor ved hjælp af en pipette, og skub den gennem et 0,22 mikrometerfilter for at sterilisere. Dernæst aliquot 200 mikroliter i et glas hætteglas med låst indsætte.
For at indsprøjte omprogrammeringsfaktorer skal du placere en bedøvet mus i den stereoaksiske ramme. Administrere passende analgesi i begyndelsen af operationen, derefter bringe spidsen af glas kapillær af injektion nålen lige over bregma. Sørg for, at kapillærspidsen er helt lige i både A-P- og M-L-fly.
Nulstil både M-L- og A-P-værdierne til 0,0 på den digitale koordinattæller. For at sikre, at dyrets hoved er i en helt flad position, skal du bruge den digitale koordinattæller til at måle D-V-koordinatværdien, når A-P-armen er på plus 2,0 og minus 2,0, samt når M-L-armen er på plus 2,0 og minus 2,0. Juster højden af tandbjælken og ørestængerne i overensstemmelse hermed.
Derefter hæves sprøjten en smule og bores et hul ved hjælp af en tandboremaskine ved injektionskoordinaterne. Begynd at bore på stedet og arbejde på en cirkulær og skånsom måde. Derefter placere et stykke bomuld gaze over det åbne snit og skyl sprøjten med saltvand opløsning.
Efter skylning, udarbejde en luftboble og derefter en mikroliter af opløsning, der indeholder den virale vektor. Sørg for, at den virale opløsning let kan visualiseres under luftboblen. Sænk derefter sprøjten, og skrider langsomt til den ønskede dybde, og sørg for, at bane er fri for knoglefragmenter.
Derefter injiceres en mikroliter af den virale opløsning med en hastighed på 0,4 mikroliter pr. minut. Når injektionen er færdig, skal der gå to minutter til diffusion, før sprøjten trækkes tilbage. Efter diffusion, langsomt trække sprøjten, indtil spidsen af kapillær er helt trukket ud af hjernen, derefter forsigtigt sutur snittet og fjerne dyret fra stereotaxic ramme.
Overvåg dyret på en postoperativ station, indtil bevidstheden er genvundet. Dyrene holdes i op til 12 uger efter virusinjektion for at give hjemmehørende glia mulighed for at omprogrammere sig til modne neuroner. For at forberede hjerne skiver til elektrofysiologi ved hjælp af en vibratome, afsnit hjernen fra den mest rostrale del ned til striatal niveau ved høj hastighed.
Derefter afsnit striatum koronal på 275 mikrometer på 0,1 millimeter per sekund. Efter hver sektion fjernes den ikke-injicerede striatalside forsigtigt og den injicerede side overføres til et hætteglas med et bundnet og iltet CREB-sans i vandbadet ved stuetemperatur. Hold hætteglasset ved stuetemperatur, indtil alle sektionerne er skåret over.
Derefter langsomt øge temperaturen i vandbadet til 37 grader Celsius og lad det i 30 minutter, derefter slukke for varmelegeme og lad det køle ned til stuetemperatur. Når en vævssektion er overført til et optagelseskammer til elektrofysiologi, monteres glaspipetten på optageelektroden, og den sænkes ned i opløsningen. Dobbelttjek elektrodens modstand.
Derefter langsomt nærmer den omprogrammerede celle med pipetten, holde et lille positivt tryk i elektroden for at undgå at tilslutte spidsen, og kontrollere, at cellen er GFP positiv, før lappe. Når cellen er lappet, skal cellen i strømklemmen opretholdes fra minus 60 til minus 70 millivolt, og der injiceres 500 millisekundstrømninger fra minus 20 til plus 90 picoampere med 10 picoampere intervaller for at fremkalde handlingspotentialer. Dette er tegn på en neuronal modning og vellykket omprogrammering.
Skift derefter til spændingsklemme og mål det indadgående natrium og forsinkede udbedring af kaliumstrømterne ved afpoleringstrin på 10 millivolt. Her er et indlæg registreret biocytin fyldt omprogrammeret neuron, som viser modne neuronal morfologi og dendritiske pigge. Her viser elektrofysiologiske optagelser af de omprogrammerede neuroner tilstedeværelsen af postsynaptiske funktionelle forbindelser med spontane aktivitetsforanstaltninger.
Spor viser den hæmmende aktivitet, der er blokeret med picrotoxin, en GABAA receptor antagonist og excitatoriske aktivitet, der er blokeret med CNQX, en AMPA receptor antagonist. De lappede neuroner viser allerede postsynaptisk aktivitet efter fem uger efter injektionen og fortsætter ved otte og 12 uger efter injektionen. Antallet af neuroner med nuværende inducerede handling potentialer også stiger over tid.
En mere detaljeret analyse afslørede flere forskellige fyring mønstre, hvor de fleste celler viser hurtig spiking aktivitet svarende til parvalbumin interneurons. Immunhistokemisk analyse efter 12 uger viste yderligere co-ekspression af journalisten GFP og parvalbumin. Efter denne procedure kan du undersøge genekspressionen med patch søge teknik eller vurdere den tre-dimensionelle synaptiske forbindelse med monosynaptisk sporing og iDISCO.
Nu, hvor det er muligt at omprogrammere hjemmehørende glia i parvalbumin udtrykke interneurons, har vi begyndt at undersøge, om disse er autentiske og kan bruges som et terapeutisk redskab. Husk at følge de etablerede protokoller og retningslinjer, når du håndterer dyr og bruger AAV-virus.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
