Bioengineering
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单轴拉伸应变下活细胞核动力学的高分辨率成像
Chapters
Summary June 2nd, 2019
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利用先前设计的设备将机械应变应用于粘附细胞, 本文介绍了重新设计的底层几何形状和具有100x 油浸目标的应变细胞高分辨率单细胞成像的定制设备。
Transcript
我们之前设计了一种装置，用于对粘附细胞施加机械应变。在目前的工作中，我们重新设计了底层的几何形状，并定制了这些应变细胞的高分辨率成像设置。这种细胞拉伸系统的主要优点是，它提供了100倍的应变细胞的高分辨率亚细胞成像。
演示底层捏造将是Vicki，一个研究助理从我的实验室。首先设计单井聚二甲基硅氧烷模具，遵循随附的文本协议。接下来，将聚二甲基硅氧烷基座的 20 个部分与一次性杯中的一个零件固化剂混合。
混合后，将聚二甲基硅氧烷混合物在0.8 bar的真空脱气器中放置30分钟，以去除混合物中的气泡。然后，将聚二甲基硅氧烷混合到模具和盘中。在此阶段，通过再次在 0.8 bar 真空中除气 30 分钟，清除任何其他气泡。
去气处理完成后，在 80 摄氏度的平地台上烘烤样品两小时。接下来，小心地从烤箱中取出样品，让样品冷却至室温。用刀片切割边缘，轻轻剥去固化的聚二甲基硅氧烷。
在直径为150毫米的聚二甲基硅氧烷上，用标记绘制两厘米的两厘米的网格。在每个正方形内，画一厘米一厘米的正方形，在四面留下0.5厘米的边距。使用刀片小心地沿着线条切割并获取方形隔间。
接下来，通过用100%丙酮孵育样品4小时，再将100%乙醇孵育4小时，然后在自动洗水中孵育4小时，进行清洁。将清洁的样品放在石蜡薄膜衬垫纸上，放在一个直径为 150 毫米的塑料盘中，并在 80 摄氏度的烤箱中干燥样品 4 小时。完成后，用石蜡膜密封盘子，并存放在冷室，直到进一步使用。
准备祖细胞，并在增殖介质中挂起它们。这些细胞的密度为每平方厘米35，000个细胞，在PDL涂层的塑料表面。将增殖介质的体积调整为每十厘米方积的三毫升。
介质体积的减少可能导致由表面张力力引起的细胞笨拙，而培养皿中较高的介质量可能会导致介质溢出。在播种后的第三天，收获细胞并使用血细胞计计数。然后，每多二甲基硅氧烷板播种3.5万个细胞，并施以700微升增殖介质。
接下来，按照制造商的说明，添加一个质化结构，将细胞的组蛋白H2B复合物与绿色荧光蛋白标记。24小时后，将聚二甲基硅氧烷样品与细胞一起安装在单轴应变装置上。然后，将所有样本中的介质更改为分化介质。
测量未拉紧的单元室长度，转动舞台千分尺螺钉，以所需的应变量增加电池舱长度。将拉伸和未拉伸的聚二聚硅氧烷样品留在孵化器中，温度为 37 摄氏度，直到成像。通过将培养箱温度设置为 37 摄氏度，准备显微镜培养箱进行实时成像。
接下来，将 100 倍油浸入目标带到中心位置，因为目标转向后将无法访问。一旦到位，拧开目标，并拧回一个目标环，使目标可以拉近细胞。然后，在目标中加入一滴油。
使用定制印刷支架，在车窗的外围涂上真空润滑脂，并在支架顶部放置一个数字零厚度的玻璃盖玻片。将塑料窗安装到显微镜舞台上。接下来，将 Z 平移阶段拧到显微镜阶段，然后移动到最顶层的 Z 位置。
从拉伸的多二甲基硅氧烷板中去除 500 微升介质，并将该介质添加到白色塑料窗的玻璃盖玻片上。然后，使用一对无菌钳子小心地将方形隔间从聚二甲基硅氧烷板中分离出来。将应变装置保持直立位置，使电池朝上，在白色塑料窗口上方，小心地反转应变装置，使任何额外的介质直接滴在玻璃盖玻片中间，细胞朝下。
使用双面胶带将应变装置的底部放在 Z 平移阶段，以固定到位。在明亮的磁场下透过目镜看时，非常缓慢地将应变装置向下移动，并将目标向上移动，以聚焦在细胞上。缓慢执行此对焦步骤，在降低 Z 平移阶段和提升目标之间交替执行。
如果 Z 转换阶段降低太多，细胞可能会压缩并因此死亡。如果我们把目标提高得过高，可能会打破玻璃盖玻片，导致介质泄漏。扫描X和Y方向的多二甲基硅氧烷板，找到具有荧光核的细胞，使用488纳米激发的脱花体。
在看亮场下的样本时，还要确保细胞具有适当的形态。记录具有488纳米波长激发的原子核的宽场或开针孔图像，记录每帧30秒间隔的光场激发细胞，总持续时间至少为30分钟。本视频中显示的聚二甲基硅氧烷底层的重新设计几何形状和成像设置可最大限度缩短细胞与目标之间的距离。
这实现了荧光标记细胞核的延时成像，使用 100 倍油浸渍目标。要测量核波动，首先绘制核区域与时间。然后，使用三阶多项式减损数据。
最后，绘制残余波动并计算残差波动的标准偏差。18小时核波动的幅度在48小时时明显减小，但24小时时没有10%的张力应变的化学诱导分化后，核波动的幅度明显降低。另一方面，化学感应加上10%的拉伸应变在24小时时显著减少，在48小时时保持不变，没有进一步减少。
需要记住的最重要的事情是，所选目标的工作距离应等于或大于电池室的深度加上盖玻片的厚度。可以重新设计底层以合并一个网格，这将有助于在应用应变之前和之后对同一细胞进行成像，因为数据集的之前和之后类型可减少实验误差的噪声。使用此成像设置，粘附活细胞中的许多亚细胞现象，如蛋白质定位或细胞成分的动力学，可以在应用机械应变的几秒钟内进行成像。
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