Imaging Integrin spänningar och cellulära kraft på Submicron upplösning med en integrativ spänningar sensorn

Denna DNA-baserade integrativ spänningssensor, eller ITS, konvertera kraftsignal till fluorescens lokalt möjliggör direkt avbildning av cellulär kraft med fluorescensmikroskopi. ITS har en hög rumslig upplösning och en hög känslighet. Aktiveringströskeln är avstämbar, vilket möjliggör selektiv bild av integrinspänning på olika nivåer.

Efter att ha fått den anpassade enkelsträngade DNA, eller ssDNA, av intresse, att konjugera RGD peptid till den tiolerade ssDNA-quencher, först lägga till 100 mikroliter av 0,5-molar EDTA i 400 mikroliter vatten till cirka 450 mikroliter av nyberedda TCEP lösning. Lägg sedan till 10 mikroliter av TCEP-EDTA-lösningen till 20 mikroliter av en millimolar thiol DNA-quencher i PBS för en 30-minuters inkubation vid rumstemperatur. Till konjugat RGD-amin med sulfo-SMCC, tillsätt 40 mikroliter av nyberedda 23-millimolar sulfo-SMCC till 100 mikroliter av nyberedda 11-millimolar RGD-aminlösning för en 20-minuters inkubation vid rumstemperatur.

För att konjugera RGD-amin SMCC med den tiolerade ssDNA-quencher, blanda hela volymen av den tioolerade ssDNA-quencher-lösningen med hela volymen av RGD-amine-SMCC-lösningen för en timmes inkubation vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen överför du lösningen till fyrgradig Celsiuslagring över natten. Nästa morgon, blanda tre-molar natriumklorid med thiol-konjugerad DNA-lösning och minus 20-graders Celsius, kyld, 100%etanol vid en en-till-10-till-25 förhållande, och placera reaktionen på minus 20 grader Celsius i ca 30 minuter.

När DNA:t har fällts upp, samla in DNA genom centrifugering, och återanvänd pelleten i PBS för mätning av DNA-koncentrationen på en spektrometer. För integrativ spänningssensor, eller ITS, syntes, blanda den övre och nedre strängen DNA-lösningar vid en 1,1-till-en-molar förhållande, och inkubera reaktionen över natten vid fyra grader Celsius innan du placerar alikvoter av blandningen på minus 20 grader Celsius för långsiktig lagring. För ITS immobilisering, päls en 29-millimeters diameter, glas-botten Petriskål med 200 mikroliter av 0,1-milligram-per-milliliter biotinylerade nötkreatur serum albumin, eller BSA-biotin, i 30 minuter vid fyra grader Celsius.

När BSA-biotin fysiskt har adsorberat på glasytan, tvätta skålen tre gånger med 200 mikroliter färska PBS per tvätt, följt av inkubation med 200 mikroliter på 50 mikrogram per milliliter avidinprotein i 30 minuter vid fyra grader Celsius. I slutet av inkubationen, tvätta skålen tre gånger med PBS som visats, och tillsätt 200 mikroliter av 0,1-mikromolar ITS för ytterligare 30-minuters inkubation vid fyra grader Celsius. I slutet av inkubationen, tvätta skålen tre gånger med PBS, lämnar den sista tvätten i skålen tills cellen plätering.

För att initiera en fisk keratocyte kultur, använd en platt-tippade pincett för att plocka en bit skala från en fisk, och försiktigt trycka på vågen på brunnen av en omodifierad glas-botten Petriskål, med den inre sidan av skalan kontakta glaset. Vänta i ca 30 sekunder för fiskskalan att ansluta sig till glasytan av skålen innan du täcker vågen med en millimeter av komplett Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium. Sedan, inkubera skalan i en mörk och fuktig låda i sex till 48 timmar vid rumstemperatur.

För att pläter keratocyterna på ITS-ytan, byt ut mediet från keratocytodlingsfatet med 1X cells lossande lösning för en tre minuters inkubering vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, byt ut den avtagbara lösningen med färskt komplett medium, och separera cellerna med skonsam pipettering. Justera sedan cellerna till lämplig koncentration för plätering och så dem på den ITS-belagda skålen i 30 minuter vid rumstemperatur före avbildning.

För kvasi-realtid integrin spänning imaging i levande celler, överföra cellerna till scenen i ett fluorescens mikroskop, och välj 40 eller 100 gånger objektivt. I bildhanteringsprogrammet ställer du exponeringstiden till en sekund och bildruteintervallet på 20 sekunder för att få en video av ITS-bilderna. Använd sedan ett lämpligt program för bildanalysprogram för att subtrahera en tidigare bildruta av ITS-videon från en aktuell ram för att beräkna ITS-signalen som nyligen producerats i det senaste ramintervallet.

Den nyproducerade ITS-signalen representerar den integrinspänning som genereras i det senaste ramintervallet och rapporterar därigenom den cellulära kraften på kvasi-realtidssätt. Här visar integrin spänning kartläggning induktion av integrin spänning vid två kraft spår under keratocyte migration. Kraftkartans upplösning kunde sedan kalibreras till 0,4 mikrometer.

Hög integrin spänningskoncentrat vid den bakre marginalen i motil fisk keratocyter. I nonmotile celler bildas ett specifikt integrinspänningsmönster som är ganska annorlunda än det som observerats i den snabba migrerande keratocyten. Fokal sammanväxningar och integrin spänningen av fisk keratocyter kan co-imaged för att utvärdera förhållandet mellan integrin spänning och cellstruktur i celler av intresse.

Med ITS blir celladhesionskraft synlig med en upplösning och en känslighet som är jämförbar med cellstrukturbildtagning. Denna teknik banar väg för studier av en kraft-struktur samspel i celler.