3 つの広く使われているアプリケーションの分子機能の空間分布を特徴付けるために最適化されているイメージング質量分析 (IMS): 組織スライス、回転楕円体、および微生物コロニー1,2,3。切片は、ホスト、ターゲットまたは関連性の低い特定の質量範囲内で生物学的条件のコンテキストにおける代謝物の局在の評価に使用できます。ただし、分子の機能の違いは最も重要かつ明らかな病的状態、たとえば、腫瘍に比較すると健康な組織。この IMS アプローチは特に疾患バイオ マーカーの検出、ただしの開始のために重要なことができる信号の識別ができなくなります (腫瘍グレード) などの病気の進行の各ステージで組織サンプルを取得、病気。空間を介して情報の交換は多くの生物学的システム、ユビキタス機能と組織スライスは、このダイナミックな化学リレーをキャプチャできません。化学交換と拡散を可視化することができる 1 つの方法は寒天プレート上に成長した微生物のコロニーの IMS小さな分子は寒天とを通じて拡散することができる、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI TOF) 質量分析法4経由で取り込むことができます。この成長のセットアップは、離散生物学的実体 (植民地) 間で交換される分子を識別するために使用することができ、代謝産物生産の方向性を決定することも。微生物コロニー成長用に設計されたプラットフォームは哺乳類セルの成長組織移植片の一次代謝を探索に適応され、IMS は in vitro 哺乳類システムの動的の化学交換の評価に使用されました。
ハイグレード漿液性卵巣癌 (HGSOC) が卵管上皮 (FTE) に由来する多くの場合、早期疾患開発5,6,中に卵巣に転移し明らかになった過去数年間で7,8. FTE の幹細胞、最終的に大きな腫瘍を形成、さらに転移、卵巣への普及であることの理由は不明です。前の研究は主に転移、卵巣卵巣の役割に焦点を当ててください。しかし、それが健康から発癌性の組織への移行が細胞代謝の大規模な破壊の結果し、変更する小分子9,10,11の生産実証最近されています。したがって、我々 の仮説、FTE と卵巣の間で交換される低分子化合物 HGSOC の主な転移に部分的に責任があります。
私たちの新しく開発された IMS プロシージャを使用して、幹の FTE と健康な卵巣組織の培養が卵巣からノルエピネフリンの生産を誘導することを決定しました。ただし、他の細胞の種類や細胞の FTE はないこの効果を引き出します。この方法の特別な利点、分子の生産および実際の分子を表す信号の交換を視覚化できる、共に、シグナルの原因を特定することが可能です。これは空間のすべての情報が失われる均質化試料の分析上の優位性です。モデル体制で明らかに卵巣にノルエピネフリンの生産を割り当てることができました。ノルエピネフリンは転移と卵巣癌の抗癌剤にリンクされており、IMS 方式が生体関連分子12,13,を発見することがこの分子の検出機能の検証が14. この検証は、私たち IMS のこの新しいアプリケーションは特に細胞形質転換に影響を及ぼす早期のイベントを理解して培養環境で小さい分子を識別するためにしようとしているグループの研究に役に立つことを提案することができます・転移。このメソッドの全体的な目標は組織や臓器、3 D 細胞培養体外または前のヴィヴォ組織によって表される間の交換の間に小さな分子の空間分布とアイデンティティを明らかにします。
我々のプロトコルは、細胞と組織の間の低分子化学通信をマッピングすることができ、我々は特に卵巣癌メタセシスの小分子を探求するためにこれを適用しました。この技術の主な利点は、細胞と組織の空間的完全性を2Dで維持しながら、ラベルフリーの方法で小分子を測定できることです。この技術により、卵巣癌転移における小分子の寄与を、標的のない方法で問い込むことができた。
これは、以前に見落とされていた新しい治療目標と経路を明らかにすることができます。この方法論は、アガロースで増殖できる他の癌や、結果として生じる細胞表現型にとって空間的成分が重要である可能性のある他の疾患に容易に拡張することができる。すべての細胞とコンポーネントが手に入り、乾燥プロセスに対する忍耐力を確保することは、このプロトコルにとって不可欠です。
急いで乾燥ステップを行うと、質の悪い質量分析データが得られることが多い。この方法の視覚的なデモンストレーションは、寒天上の組織または微生物を使用する典型的なイメージング質量分析実験から大きく逸脱するため、サンプル調製および乾燥ステップを理解するのに役立ちます。まず、ホットプレートでアガロースを摂氏70度で液化します。
ITO処理スライドの上に8ウェルディバイダーを置きます。標準的なトリプシン処理を介して、MOE細胞を15ミリリットル円錐形チューブ、遠心分離機に集め、DMEM培地を1回加えて再懸濁し、150マイクロリットル当たり50,000細胞の濃度を得る。分割されていない共同培養の場合は、鉗子を使用して4つの井戸の中心に卵巣外植を加えます。
めっきの直前に、200マイクロリットルの細胞懸濁液と200マイクロリットルのリ定量アガロースを個々の2ミリリットルチューブに組み合わせます。ピペットの際に気泡を避けてください。すぐに、各ウェルに細胞アガロース混合物の300マイクロリットルを追加し、井戸間の漏れや混合を確実にするために、仕切りに連続的な穏やかな下向き圧力を適用します。
気泡がなく、卵巣が井戸の中央に残っていることを確認してください。ピペット状のアガロースが卵巣を乱した場合は、ピペットチップをそっと使用してアガロースが冷める前に中央に配置します。次に、加湿インキュベーターで37°C、炭酸ガス5%でスライドをインキュベートします。
分割された共同培養物の場合は、薄くて滑らかなプラスチックから仕切り分げをカットします。滅菌、使い捨て媒体の洗面器の側面が使用される。井戸の斜辺にぴったりと収まるほど広く切ります。
ITO処理スライドの上に8ウェルディバイダーを置き、プラスチック製の仕切り機を斜めに井戸に挿入します。先に行われたように細胞培養を調製し、2ミリリットルチューブに100マイクロリットルの細胞懸濁液と100マイクロリットルのリケ化アガロースを組み合わせます。直ちに、150マイクロ