Immunology and Infection
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Redding van recombinante Zika virus uit een bacteriële kunstmatige chromosoom cDNA kloon
Chapters
Summary June 24th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
De recente epidemie van het Zikavirus wijst op het belang van het opzetten van omgekeerde genetische benaderingen om vaccins en/of therapeutische strategieën te ontwikkelen. Hier beschrijven we het protocol om een infectieus recombinant Zikavirus te redden van een volledige cDNA-kloon, geassembleerd in een bacterieel kunstmatig chromosoom onder controle van het humaan cytomegalovirus onmiddellijk-vroege promotor.
Transcript
Het algemene doel van deze experimentele procedure is de generatie van infectieuze recombinant Zika virus van een full-length cDNA kloon, geassembleerd in een bacteriële kunstmatige chromosoom onder de controle van de menselijke cytomegalovirus onmiddellijk-vroege promotor. De ontwikkeling van omgekeerd genetisch systeem voor RNA-virussen zoals het Zika-virus maakt het mogelijk om het virusgenoom direct te manipuleren om meerdere aspecten van de virale biologie en pathogenese te bestuderen en vaccinstrategie te ontwikkelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de bouw van Zika virus infectieuze kloon als een bacteriële kunstmatige chromosoom overwint de toxiciteit in verband met het flavivirus genoom en maakt de redding van infectieuze virus door directe transfectie van de BAC cDNA kloon in gevoelige cellen.
Deze methode kan worden toegepast op de bouw van stabiele en volledig functionele infectieuze cDNA-klonen voor andere flavivirussen en andere positiefstrengse RNA-virussen. Om deze procedure te beginnen, de bouw van de Zika virus cDNA kloon zoals beschreven in het tekstprotocol, met behulp van toegeëigende beperking sites. Vier DNA-fragmenten verspreid over het Zika-virusgenoom geflankeerd door de menselijke CMV-promotor aan het vijfstemaal en het hepatitis deltavirus ribosoom en de beëindiging van het rundergroeihormoon en polyadenylation sequenties aan het driestemaal worden verzameld in een bacterieel kunstmatig chromosoom plasmide.
Ten eerste, groeien een enkele kolonie van E.coli DH10B die de pBAC-Zika virus besmettelijke kloon in vijf milliliter van LB medium met chlooramhenicol gedurende acht uur op 37 graden Celsius met zachte schudden. Voeg vervolgens 500 milliliter van het LB-medium met chlooramfenicol toe aan een kolf van twee liter. Voeg een milliliter van de bereide bacteriële cultuur aan de kolf en groeien de cellen op 37 graden Celsius voor 14 tot 16 uur tot de OD600 is ongeveer 0,6 tot 0,8.
Gebruik hierna een commerciële kit die speciaal is ontwikkeld voor BAC-zuivering om de BAC-infectie cDNA-kloon te zuiveren door de instructies van de fabrikant te volgen. Een dag voor de transfectie, plaat Vero cellen in de putten van een zes-put plaat bij een dichtheid van 500,000 cellen per goed in groeimedium. Om de transfectiemix voor te bereiden, voegt u vier microgram van de BAC cDNA-kloon toe aan 250 microliter serum met een verlaagd medium en meng voorzichtig.
Verdun in een aparte buis 12 microliter transfectiemiddel in 250 microliter serum met verlaagd medium. Vortex te mengen en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Combineer vervolgens de verdunde BAC cDNA met het transfectiemiddel.
Meng zorgvuldig en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 tot 30 minuten. Gebruik tijdens deze incubatieperiode groeimedium zonder antibiotica om de Vero-cellen te wassen en laat de cellen in één milliliter vers medium zonder antibiotica. Verdeel vervolgens de 500 microliter van de cDNA en het transfectiereagensagemengsel op de Vero-cellen dropwise.
Rock de plaat heen en weer om de cellen te mengen en uit te broeden in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende zes uur. Verwijder hierna het transfectiemedium en voeg twee milliliter vers groeimedium toe met antibiotica. Incubeer de cellen in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide, om ervoor te zorgen om elke dag te controleren op inductie van cytopathische effect.
Na vier tot zes dagen van transfectie, wanneer de CPE is ongeveer 50 tot 75%verzamelen van de weefselkweek supernatants in 15-milliliter conische buizen en centrifuge gedurende 10 minuten om cellulaire puin te verwijderen. Oogst vervolgens de supernatants met een recombinant Zika-virus en gooi de celkorrels weg. Aliquot de supernatant in cryotubes en bewaar ze op min 80 graden Celsius.
Om te beginnen, groeien Vero cellen tot 90%samenvloeiing. Was de cellen twee keer met PBS en infecteer ze met het geredde virus met de veelheid van infectie van 0,1 in groeimedium met 2%FBS. Plaats de platen van cellen in een bevochtigde couveuse op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en gesteente elke 15 minuten gedurende de 90 minuten adsorptieperiode.
Na virale adsorptie, verwijder het virale entmateriaal en voeg vers groeimedium met 2%FBS toe. Incubeer drie of vier dagen onder dezelfde omstandigheden die eerder werden gebruikt. Wanneer de CPE is ongeveer 75% verzamelen van de weefselcultuur supernatant en centrifuge om cellulaire puin te verwijderen.
Oogst vervolgens het supernatant met recombinant Zika-virus en gooi de pellet weg. Aliquot de supernatant in cryotubes. Plaats de buizen in een vrieskast en bewaar ze op min 80 graden Celsius.
Wanneer u klaar bent, verwijder dan een virus aliquot uit de vriezer en bepaal de virale titer door plaque test zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie wordt een stabiele cDNA-kloon over de volledige lengte van de Zika-virusstam Rio Grande do Norte Natal gegenereerd door achtereenvolgens vier overlappende cDNA-fragmenten in het bacteriële kunstmatige chromosoom pBeloBAC11 te klonen met behulp van conventionele kloonmethoden en unieke beperkingsplaatsen in het virale genoom. Deze full-length cDNA kloon werd geflankeerd aan het vijf-prime einde door de menselijke cytomegalovirus promotor om de expressie van virale RNA in de kern van doorfecte cellen en aan de drie-prime einde door de hepatitis delta virus ribosoom gevolgd door de rundergroei beëindiging hormoon en polyadenylation sequentie om RNAs met de exacte drie-prime einde van het virale genoom te produceren.
Zodra de BAC cDNA is geassembleerd, kan het infectieuze virus gemakkelijk worden hersteld na de directe transfectie van gevoelige Vero-cellen met de BAC cDNA-kloon met behulp van kationische liposomen. Met behulp van deze aanpak, R Zika virus RGN kan worden gered met titers hoger dan een miljoen plaque-vormende eenheden per milliliter. Bovendien veroorzaakt het geredde virus een duidelijk cytopathisch effect en genereert het homogene plaques van ongeveer twee millimeter groot.
De geredde virusidentiteit wordt bevestigd door middel van immunofluorescentieanalyse met behulp van een specifiek monoklonal antilichaam voor het Zika-virus E-eiwit. Over het algemeen tonen deze resultaten aan dat infectieuze recombinant Zika-virus kan worden gered van full-length cDNA klonen geassembleerd in een BAC. Samengevat hebben we een krachtige Zika virus omgekeerde genetische benadering ontwikkeld op basis van het gebruik van een bacterieel kunstmatig chromosoom dat kan worden aangepast om de stabiele en functionele infecties te genereren met cDNA-kloon van andere positieve-streng RNA-virussen om de studie van de pathologie te vergemakkelijken, om een vaccin te ontwikkelen en of om de identificatie van geneesmiddelen met antivirale activiteit te vergemakkelijken.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
