Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Vurdering af cellulære immunrespons i frugtflue Drosophila melanogaster, ved hjælp af en i Vivo fagocytose Assay
Chapters
Summary April 10th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol beskriver en in vivo fagocytose assay i voksen Drosophila melanogaster at kvantificere phagocyt anerkendelse og clearance af mikrobielle infektioner.
Transcript
Denne in vivo fagocytose assay giver forskerne mulighed for at udføre genetiske skærme og genom-dækkende forening undersøgelser for at identificere nye gener, der regulerer fagocytose i voksne blodlegemer. Dette eksperiment er kvantitativt, let at udføre, og kan anvendes til screening af levende dyr for værtsfaktorer, der påvirker patogen anerkendelse, optagelse, og clearance. Efter at trække tyndvægsglas kapillærer med en nål puller, skal du bruge et mikrometer til at holde nålen under et mikroskop, og bruge nummer fem, fine-point, rustfrit stål pincet til at bryde spidsen til en 100-mikrometer spids diameter.
For at måle mængden af væske, der vil blive injiceret i hver flue, indlæse en kapillær nål med sterile 5% mad farve i PBS, og udvise væsken på en dråbe mineralsk olie på en 0,01-millimeter fase mikrometer. Dispensere 10 mikroliter af 1,6 milligram per milliliter partikler på en lille firkant af Parafilm, og træk væsken ind i nålen. Monter nålen i injektordysen, og line den bedøvede fluer langs deres udpegede område på fluepuden, ventrale side op, med hovederne orienteret mod forsiden af puden.
Placer hætteglassene i tilsvarende områder på bænken, og injicer fluerne i øverste hjørne af maven med fem, 100-millisekundpumper af væske til at levere omkring 10 nanoliter af partikler i alt. Hver flue overføres til det relevante hætteglas, efterhånden som det injiceres, og hætteglasset tages i betragtning. Dernæst indlæses en ny nål med 0,4% Trypan Blue-opløsning, og indstil pneumatiske injektor til gated, så en konstant luftstrøm kan skubbe væsken ud af nålen.
30 minutter efter den første injektion injiceres hver flue abdomen med Trypan Blue, indtil maven er fuld og udspilet. Monter fluerne på mikroskop dias med elektrisk tape, ventrale side ned, skubbe vingerne til siden af fluen for at sikre dem til båndet. Skub derefter forsigtigt hovedet ind i båndet for at sikre, at fluen ikke bevæger sig.
Umiddelbart efter alle fluorescens mikroskop er blevet sikret, billede insekterne, en ad gangen, på en 25 eller 32 gange forstørrelse på en omvendt fluorescens mikroskop knyttet til et digitalt kamera og computer, der fokuserer på dorsale fartøj af hver flue ved hjælp af computersoftware til det digitale kamera. Derefter skal du registrere eksponeringstiden og forstørrelsen mellem eksperimenter. Hvis du vil kvantificere fluorescensen, skal du åbne et passende billedanalyseprogram og åbne et billede.
For at måle røgrørsintensiteten af dorsale beholderen tegnes en polygon rundt om dorsale beholderen, og der skal vælges Mål for at registrere fluorescensintensiteten inde i polygonen. For at bestemme baggrundsfluorescensintensiteten skal du kopiere den første polygon og flytte den til et område, der støder op til dorsalbeholderen for hver fluorescensintensitet for hver fluorescens. Vælg derefter Målpunkt, og post fluorescensintensiteten i baggrundsområdet.
For at normalisere dorsalbeholderens fluorescens ved baggrundsfluorescens skal du efter måling af fluorescensintensiteten i resten af fluoreferne i resten af fluoreferne ved at fordele dorsalbeholderens fluorescens med baggrundsfluorescensen og beregne den gennemsnitlige normaliserede dorsale beholderfluorescensintensitet af alle fluorescensintensiteten af alle fluierne i én stamme. Efter at være blevet monteret ventrale side ned på et stykke elektrisk tape, de første to segmenter af maven, hvor dorsale fartøj er placeret, er klart synlige. Der opstår vigtige kilder til eksperimentelle fejl ved procedurens injektions- og billeddannelsestrin.
Brug af den samme nål til at injicere flere fluer kan få det tilstoppet med fluevæv eller partikler. Fluer, der ikke får nok Trypan Blue fluorescens klart i hele deres mave, hvilket kan reducere forholdet mellem dorsal beholderen til baggrunden fluorescens, og dermed mindske den sande fluorescens intensitetsforhold af dyret. Fluer skal fotograferes, mens immobiliseret af kuldioxid, som aktivt bevæger fluer producere slørede billeder, der ikke kan kvantificeres.
En mutant linje fra Zuker-samlingen af ethylmethansulfonerede fluer er ude af stand til at fagocytosegram-negative og grampositive bakterier og udviser næsten ingen dorsal beholderfluorescens i in vivo fagocytosis-analysen, parret med den isogene baggrund Zuker-stamme og en anden fælles laboratoriekontrolstamme. Hold styr på den tid og rækkefølge, hvori fluer injiceres for at sikre, at fluer er på sammenlignelige stadier af patogengenkendelse og optagelse, når de afbildes. De molekylære mekanismer, der ligger til grund for fagocytiske defekter, kan bestemmes ved at studere enkelte hæmocytter med konfokal mikroskopi eller efter fluorescensaktiv cellesortering eller ved magnetisk perleisolering af voksne hæmocytter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
