Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

Este sistema organoide de conductos biliares extrahepático murino puede abordar el acceso limitado a los modelos de colangiopatías preclínicos y las limitaciones de las células madre pluripotentes y los modelos organoides de colangiocito derivados del hígado. Nuestro modelo es específico de tejido adulto, reduccionista, reproducible y de tiempo y costo y rentable. Será de especial beneficio para los laboratorios que no tienen acceso a los tejidos humanos.

Nuestra técnica permite el cultivo de un número casi ilimitado de colangiocitos extrahepáticos de los conductos biliares para estudiar la regeneración tisular y las interacciones de célula a célula. Demostrando el procedimiento estará Junya Shiota, un post-doc de mi laboratorio. Para el aislamiento intrahepático del conducto biliar, coloque el ratón adulto en una posición supina y abra la cavidad abdominal a lo largo de la línea media.

Retirar el hígado para descansar sobre el diafragma y utilizar un hemostat para tirar suavemente del duodeno proximal para revelar el conducto biliar común inmediatamente debajo del hilo hepático. Usa un bisturí para separar el conducto biliar extrahepático de los tejidos circundantes. Sosteniendo el extremo proximal del conducto biliar común con fórceps, disecciona el conducto distalmente justo por encima de su coyuntura con el duodeno antes de diseccionar el extremo proximal del conducto del hígado.

Coloque inmediatamente el conducto biliar extrahepático aislado en una placa de vidrio que contenga un tampón de lavado en frío sobre hielo, luego limpie el conducto biliar del tejido circundante y miga en secciones de 0,5 milímetros. Cuando todo el tejido haya sido picado, transfiera las secciones a un tubo que contenga 500 microlitros de tampón de disociación para una incubación de 20 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la disociación, neutralice el tampón con 500 microlitros de medio de cultivo de células heladas y triturar la suspensión de tejido 20 veces a través de una aguja de calibre 18 y luego 20 veces a través de una aguja de calibre 20.

Luego filtre la suspensión celular resultante a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Para establecer un cultivo organoide biliar, recoja las células por centrifugación y retire cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender el pellet en un mililitro de PBS estéril y helado y transferir las células a un tubo de 1,5 mililitros para una segunda centrifugación.

Resuspender el pellet lavado en 120 microlitros de matriz de sótano licuado, helado y placa 40 microlitros de células en el centro de cada uno de los tres pozos de una placa de 37 grados Celsius calentada, 24 pozos, luego coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejido de 37 grados Celsius durante unos 15 minutos. Cuando la matriz del sótano se haya solidificado, agregue 600 microlitros de 37 grados Celsius medio de siembra a cada pozo antes de devolver la placa a la incubadora. Después de tres días y cada tres días a partir de entonces, reemplace el medio de siembra por 600 microlitros de medio de cultivo organoide fresco, monitoreando el crecimiento organoide regularmente con un microscopio invertido.

Para pasar los cultivos extrahepáticos del conducto biliar, pipetee los organoides de cada pozo con 400 microlitros de PBS helado 10 veces por pozo antes de transferir el contenido del pozo a tubos individuales de 1,5 mililitros. Pasar cada mezcla a través de una aguja de calibre 25 cuatro veces para disociar los organoides y recoger las células por centrifugación. A continuación, resuspender las celdas en la matriz del sótano en la proporción adecuada para el re-ensaquipción.

Para el almacenamiento de organoides de conductos biliares extrahepáticos a largo plazo, lave cada pozo de organoides con PBS a temperatura ambiente sin alterar las caídas de la matriz del sótano y agregue 500 microlitros de medio de congelación helada a cada pozo. Resuspender suavemente los organoides y transferir la mezcla a viales criogénicos individuales, luego colocar los viales a menos 80 grados Celsius durante 48 horas antes de transferir los organoides a un tanque de nitrógeno para su almacenamiento a largo plazo en una fase de vapor. Para preparar los organoides para la incrustación de parafina, sustituya el medio por 500 microlitros de cuatro grados Celsius PBS y transfiera la suspensión de cada pozo a tubos individuales de 1,5 mililitros que contengan matriz sótano licuada.

Recoger los organoides por centrifugación y utilizar una punta de pipeta P1000 modificada para eliminar cuidadosamente los sobrenadantes sin perturbar los pellets. Luego agregue un mililitro de hielo frío, 4%paraformaldehído a los organoides para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, reemplace el fijador por un mililitro de PBS a temperatura ambiente para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente y lave los organoides por centrifugación tres veces.

Después del último lavado, resuspendir los organoides en un mililitro de 30%etanol para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de una incubación de cinco minutos en un mililitro de 70% etanol a temperatura ambiente. Al final de la incubación del 70%etanol, recoger los organoides por centrifugación y resuspender los organoides en un mililitro de 100%etanol durante cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación del 100% de etanol, el gel de procesamiento de muestras de calor en un microondas durante 20 segundos o hasta que esté licuado, y agregue 50 microlitros del gel liquificado a cada tubo de organoides.

Coloque los tubos sobre hielo hasta que el gel de procesamiento de la muestra se solidifie y transfiera la gota de organoides de cada tubo entre las almohadillas de esponja azules en un cassette para su posterior procesamiento en el embedder de parafina. Coloque el cassette en un procesador de tejidos programado durante 15 minutos por paso, luego se sectione los organoides incrustados en parafina en gel de procesamiento de muestras a cuatro micrómetros por sección para la tinción inmunohistoquímica y el análisis de acuerdo con los protocolos estándar. La eficiencia extrahepática del revestimiento organoide de las vías biliares es de aproximadamente el 2% cuando se aísla de ratones neonatales o adultos.

Después del paso dos, la eficiencia de chapado de organoides extrahepáticos del conducto biliar derivados de ratones adultos aumenta al 11% y permanece estable. La mayoría de los organoides demuestran una morfología quística en todos los pasajes con organoides irregulares raros. Los organoides alcanzan un pico de crecimiento de cinco a siete días, después de lo cual comienzan a acumular escombros intraluminales y se deterioran.

Por lo tanto, para el mantenimiento del cultivo organoide, los organoides deben dividirse cada siete a 10 días. Cuando se analizan con inmunofluorescencia, los organoides extrahepáticos del conducto biliar consisten en una población pura de células epiteliales marcadas por E-cadherina. Las células organoides también muestran marcadores de células progenitoras biliares, así como marcadores de diferenciación biliar.

Es importante destacar que un alto porcentaje de células organoides poseen un cilium primario marcado por la alfa Tubulina acetilada, que es una característica de los colangiocitos normales y sugiere una polarización de células organoides apropiada. Se requiere una estrecha adherencia a la condición de temperatura descrita. La disección meticulosa de los conductos biliares evita la contaminación de las células del páncreas.

La pérdida de material celular se puede evitar mediante una manipulación cuidadosa después de la centrifugación. Estos organoides se pueden utilizar como modelos preclínicos, manipulados genética y farmacológicamente, o utilizados para probar fármacos y los efectos de agentes infecciosos. Este método puede ser utilizado por laboratorios que quieren aprovechar los modelos de ratón modificados genéticamente para estudiar más a fondo los mecanismos de la biología del colangiocito.