Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantifisering av voksende Human antigen-spesifikke CD4+ T celler bruke Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester
Chapters
Summary June 4th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Presentert her er en protokoll for å måle voksende CD4+ T-celler som svar på antigen proteiner eller peptider ved hjelp av fargestoff fortynning. Denne analysen er spesielt følsom for sjeldne antigen-spesifikke T-celler og kan endres for å lette kloning av antigen-spesifikke celler.
Transcript
Denne protokollen gir en plattform for å studere CD4T celleresponser som ofte er svake og vanskelige å oppdage. Denne teknikken gjør det mulig for deteksjon, opplisting og isolering av CD4T-celler uten forkunnskaper om antigenpresentasjon. Den største fordelen er analysen av CD4T-celler som er ganske ofte sjeldne populasjoner forbundet med autoimmune forhold som type en diabetes.
Ved å få den perifere blodprøven fra en sunn donor, fortynne blodet i PBS i minst ett til to forhold før lagdeling 35 milliliter blod over 15 milliliter tetthet gradient medium i en 50 milliliter tube. Skill cellene etter tetthet gradient sentrifugering og fjern ca 20 milliliter av det resulterende toppplasmalaget. Deretter samler du hvite blodlegemer laget tar vare for å unngå røde blodlegemer pellet og vaske cellene tre ganger i frisk PBS.
Etter telling, fortynne cellene til en gang 10 til sjette perifere blod mononukleære celle eller PBMC per milliliter PBS konsentrasjon. Tilsett 300 mikroliter celler for hver kontroll i individuelle 10 milliliter rør. Etter topping hvert rør med PBS, sediment cellene ved sentrifugering og resuspend cellene på en gang 10 til de sjette cellene per milliliter av RP5 middels konsentrasjon.
Deretter plate 100 mikroliter celler per kontroll til hver av tre brønner av en 96 brønnplate som inneholder 100 mikroliter RP5 medium per brønn. Plasser platen i cellekulturinkubatoren i syv dager. Deretter overfører du de gjenværende PBMCene til et nytt 50 ml ml og legger til en mikroliter cfse arbeidslagerløsning per en milliliter cellefjæring til siden av røret.
Inverter raskt røret flere ganger for å blande og plassere cellene i en cellekulturinkubator i fem minutter. På slutten av inkubasjonen, arrester reaksjonen med fem milliliter RP5 medium og samle cellene ved sentrifugering. Resuspend pellet på en gang 10 til sjette PBMCs per milliliter frisk RP5 medium og legge til en milliliter celler til en 10 milliliter rør per antigen som skal testes.
Tilsett deretter 100 mikroliter celler per antigen til hver av tre brønner av en 96 brønnplatebrønn som inneholder 100 mikroliter RP5-medium supplert med fortynnet interesseantigen per brønn. Plasser platen i cellekulturinkubatoren i syv dager. For å farge CD4 + T cellepopulasjoner for strømning cytometrisk analyse, på slutten av kulturen overføre hele volumet av celler fra hver brønn til individuell fluorescens aktivert celle sortering eller FACS rør.
Vask hver prøve med en milliliter PBS supplert med 0,1% føtal kalv serum eller FCS. Resuspend pellets i en passende anti-menneskelig CD4 antistoff i 100 mikroliter pbs pluss FCS per rør. Inkuber cellene ved fire grader Celsius i 20 minutter beskyttet mot lys.
På slutten av inkubasjonen, vask prøvene i en milliliter frisk PBS pluss FCS per rør og resuspend pellets i 100 mikroliter av friske PBS pluss FCS. Umiddelbart før analysen, legg til en mikroliter propidiumjodid til hvert rør for å tillate utelukkelse av døde celler. Gate lymfocytter i henhold til deres fremover og side scatter områder.
For å utelukke apoptotiske celler, gate fremover scatter området versus propidium iodide negative celler og bruke de uopphetede cellene til å angi en spenning baseline for de ikke-fluorescerende celler. Still inn spenningene for CD4-antistofffluoren og CFSE-signalet slik at fluorescerende signal er under 1000 for hver. Bruk cfse- og CD4-prøvene med én fargekontroll til å bekrefte et positivt fluorescerende signal for hver farge ved hjelp av spenningene som er angitt med de uopphetede cellene.
Siden CFSE og propidiumjodid har en viss spektral overlapping, justerer du kompensasjonen for å trekke propidiumjodidfluorescensen fra CFSE-fluorescensen til CFSE bare-prøven ikke gir et signal i propidiumjodidkanalen. Når alle prøvene er analysert, beregne celledelingsindeksen ved å dele antall delte celler med 5000 udelte celler fra antigen stimulert gruppe med gjennomsnittlig antall delte celler per 5000 udelte celler fra cellene dyrket uten antigen. Nesten alle donorer viser en sterk T-celle respons på Stivkrampe toxoid etter in vitro stimulering fordi donorene har blitt vaksinert gjør Stivkrampe toxoid en nyttig positiv kontroll antigen.
Spredningen av CD4 + T-celler fra ustimulerte PBMCer er imidlertid minimal. Etter syv dager med stimulering med humant pro-insulin C-peptid, kan pro-insulin C-peptid spesifikke CD4 + T-celler oppdages i perifert blod hos en person med type en diabetes. PBMC stimulert med influensa A virusmatriseprotein viser også spredning.
Samlet viser disse dataene at analysen kan utføres ved hjelp av proteiner i full lengde samt korte syntetiske peptider. FACS-komponenten i denne metoden kan utføres ved hjelp av en cellesorteringsstrømsytometer. Ved hjelp av en cellesortering kan de antigenspesifikke T-cellene isoleres på enkeltcellenivå for nedstrøms analyse.
Denne metoden har tillatt for oppdagelsen av CD4T celleresponser hos personer med tidlig utbruddet type en diabetes. Analyse av disse sjeldne T-cellepopulasjonene ved hjelp av andre metoder presenterer ulike tekniske utfordringer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
