Misurazione dei tassi potenziali di riduzione del nitrato dissimiliva all'ammonio sulla base ^{di 14}NH₄^/15NH₄^- Analisi tramite conversione sequenziale in N₂O

Gli ecosistemi costieri e marini sono importanti come bacini idrici, per rimuovere i nitrati dagli ecosistemi terrestri. Il nitrato nell’ambiente acquatico può essere consumato contemporaneamente da diversi processi. Come denitrificazione, anammox e DNRA.

Mentre studi precedenti hanno dimostrato che la DNRA è potenzialmente colpevole di denitrificazione, studi che misurano l’attività della DNRA sono ancora molto limitati rispetto a quelli che misurano la denitrificazione. Nel nostro protocollo, forniamo una procedura dettagliata per la misurazione del potenziale tasso DNRA nei campioni ambientali. Crediamo che il potenziale tasso DNRA possa essere calcolato dall’accumulo di ammonio etichettato N15 con aggiunta di nitrato etichettata N15.

Il vantaggio del nostro metodo rispetto ad altri metodi, è che l’ammonio viene infine convertito in protossido di azoto, che ha un basso background atmosferico. Inoltre non è saggio che abbiamo misurato l’ossido di azoto tramite spettrometro di massa a gascromatografia quadrupolo. Che è meno costoso e facile da gestire rispetto a uno spettrometro di massa con rapporto isotopico.

Per prima cosa, posiziona un pezzo di nastro PTFE da 60 millimetri su un piccolo foglio di foglio di alluminio. Intasare un filtro in fibra di vetro a 450 gradi Celsius per quattro ore in un forno a marmitta. Quindi posizionare il filtro in fibra di vetro un po ‘sopra il punto centrale dell’asse più lungo del nastro.

Successivamente, individuare 20 microlitri di 0,9 moli per litro di acido solforico al centro del filtro in fibra di vetro e piegare immediatamente il nastro PTFE utilizzando timbro a terminazione piatta e pinzette dritte. Capovolgere il nastro PTFE sul filtro in fibra di vetro, quindi sigillare entrambi i lati del nastro PTFE piegando e quindi premendo saldamente il bordo con le pinzette. Utilizzando le pinzette, piegare l’estremità aperta del nastro PTFE e premere il bordo.

Sigillare l’estremità aperta del nastro PTFE premendo saldamente il bordo con le pinzette, facendo attenzione a non premere il filtro in fibra di vetro. Trasferire 30 milligrammi di ossido di magnesio ashed, in una fiala di vetro da 20 millilitri, e posizionare l’involucro PTFE nel flaconcino. Trasferire cinque millilitri di un campione o di uno standard precedentemente preparato nel flaconcino contenente l’ossido di magnesio e l’involucro PTFE.

E chiudere immediatamente la fiala con un tappo di gomma butile grigia. Quindi, sigillare il flaconcino con un cappuccio in alluminio. Agitare le fiale a 150 giri/min per tre ore a quattro gradi Celsius in condizioni di buio.

In seguito, rimuovere il cappuccio in alluminio e il tappo in gomma butile da ogni flaconcino. Rimuovere la busta PTFE da ogni flaconcino utilizzando una pinzetta a punta e sciacquare accuratamente la busta e le pinzette con acqua scambiata di ioni. Quindi, pulire la busta e le pinzette con carta da pulire e posizionare la busta su carta da pulire fresca.

Aprire la busta PTFE con pinzette a punta piatta e appuntita in ordine inverso dei gradini pieghevoli. Usando una pinzetta piatta, tenere l’area periferica del filtro in fibra di vetro, dove si suppone che l’acido solforico non venga assorbito. E trasferirlo in una provetta a vite da 11 millimetri.

Risciacquare le pinzette con acqua scambiata di ioni e pulirle con carta da pulire. Aggiungere un millilitro di ione scambiato d’acqua a ogni provetta. Chiudere le provette con tappi a vite rivestiti in PTFE e lasciare riposare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente, per eluire completamente il catione di ammonio dal filtro in fibra di vetro.

In seguito, aprire il tappo a vite, aggiungere due millilitri di un reagente di soluzione ossidante persolfuro precedentemente preparato alla provetta e chiudere saldamente il tubo con un tappo a vite, per evitare qualsiasi perdita o contaminazione durante i seguenti passaggi. Metti le provette su un rack, avvolgile in un foglio di alluminio a doppio strato e autoclavali in posizione verticale per un’ora a 121 gradi Celsius. Mescolare 100 millilitri di sterile 40 millimoli per litro tampone fosfato, e 100 millilitri di sterile 30 millimoli per litro glucosio asettico.

Aggiungere uno stock di glicerolo di P.clorooraphis a 200 millilitri della soluzione di glucosio tamponato al fosfato, in un pallone Erlenmeyer da 300 millilitri. E epurare con un flusso di elio ultra puro per un’ora. Successivamente, erogare due millilitri di una sospensione denitrificatore precedentemente preparata in cinque flaconcini millilitri.

Tappare ogni fiala con un tappo in gomma butile grigia e una chiusura in alluminio. Sostituire l’aria Headspace con elio ultra puro, aspirando per tre minuti e caricando l’elio per un minuto. Impostare la pressione positiva del gas Headspace su 1,3 atmosfere, per evitare contaminazioni involontarie dell’aria.

Iniettare un millilitro di un campione o standard attraverso il tappo di gomma butile, utilizzando una siringa monouso da un millilitro. Quindi, incubare le fiale durante la notte a 25 gradi Celsius, in condizioni di buio. Il giorno seguente, iniettare 0,3 millilitri di sei talpe per litro idrossido di sodio per fermare la denitrificazione e assorbire l’anidride carbonica Headspace, che altrimenti disturberà l’analisi dell’ossido di azoto.

Perché l’anidride carbonica e il protossido di azoto hanno lo stesso peso molecolare. Determinare le quantità di protossido di azoto con un peso molecolare di 44, 45 e 46, nel gas Headspace utilizzando quadrupolo GC/MS con una porta di iniezione modificata. I risultati rappresentativi sono stati derivati da 15 esperimenti di tracciamento dell’azoto di sedimenti di saline creati dal terremoto del Grande Giappone orientale del 2011 nell’area lunare della città di Kesennuma e della prefettura di Miyagi, in Giappone.

Un aumento della concentrazione di ammonio etichettata durante tutto il periodo di incubazione è stato osservato per tutti i sedimenti raccolti nelle zone subtidali e intertidali. I tassi DNRA erano tra 24,8 e 177. E sono paragonabili ai valori riportati negli studi precedenti, ma superiori ai valori derivati da ambienti simili.

L’alto tasso di DNRA, può essere spiegato dal fatto che la palude salata viene utilizzata come campo di coltivazione prima del terremoto. Coerentemente con la speculazione, il tasso di DNRA nella zona intertidale, che è composto ricco e organico rispetto alla zona subtidale, era più alto. Il nostro protocollo è ampiamente applicabile all’analisi delle vie metaboliche, che comporta la formazione di ammonio e aggiunte di tracce N15.