Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid
Chapters
Summary May 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.
Transcript
Lipoprotein deeltjes zijn inheemse transportvoertuigen. De verrijking van vreemde stoffen vergemakkelijkt het gebruik ervan als spoorvervoerder. Specifieke etikettering van moleculen of hele deeltjes maakt het mogelijk om de cellulaire opname te meten.
De twee verrijkingsmethoden zijn snel en gebruiksvriendelijk en kunnen worden aangepast voor een breed scala aan stoffen. Het aantonen van de procedure zal Markus Axmann en Andreas Karner, twee postdocs van mijn lab. Om te beginnen met delipidatie in een rookkap, meng een tot twee milliliter bereide HDL-oplossing met vijf milligram HDL-deeltjes met 50 milliliter vooraf gekoelde drie-tot-twee mengsel van ethanol diethylether in een conische centrifugatiebuis.
Incubeer gedurende twee uur bij negatieve 20 graden Celsius. Centrifuge op 2500 keer g gedurende 10 minuten bij negatieve 10 graden Celsius. Gooi de supernatant, resuspend de pellet in 50 milliliter van voorgekoelde ethanol diethylether mengsel, en vortex kort.
Broeden een tweede keer voor twee uur bij negatieve 20 graden Celsius. Centrifuge opnieuw op 2500 keer g gedurende 10 minuten bij negatieve 10 graden Celsius. Dan invoegen buizen leveren stikstof gas stroom om de pellet te drogen.
En resuspend het in 250 microliters van buffer A.Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford eiwittest of een andere geschikte. Het is van cruciaal belang om restanten van het ethanoldiëtheremenamengsel te verwijderen, omdat deze oplosmiddelen de betrouwbaarheid van apolipoproteïnen zouden remmen. Vervolgens verdunnen tot een laatste concentratie van een milligram eiwit per 250 microliter buffer A.Insert een slang leveren inert gas in de oplossing deel in de buis.
Bewaar de oplossing indien nodig 's nachts op vier graden Celsius onder de inerte gasatmosfeer. Om te beginnen met de reconstructie, in een schone glazen buis, meng 100 microliter CO, 13,5 microliter van C, en 500 microliters van pc. Draai vervolgens de glazen buis terwijl u stikstofgas in de buis spoelt om het mengsel te drogen om een homogene oppervlaktelaag op te leveren. In een 0,5-milliliter reactiebuis, bereid een verse 30-millimolar spermine oplossing in buffer A.Then Meng 100 microliter van 10-micromolar synthetische microRNA met 100 microliter van spermine oplossing in een twee-milliliter reactiebuis.
En 30 minuten uitbroeden bij 30 graden Celsius. Breng vervolgens de geïncubeerde 200-microliteroplossing over in de glazen buis om de voorbereide PC-CO-C mastermix-oppervlaktelaag te rehydrateren. En voeg dan 50 microliter van een 30 milligram per milliliter natriumdeoxycholaat oplossing.
Roer twee uur lang op vier graden Celsius. Voeg daarna 250 microliter van de gedelipde HDL-oplossing toe aan de glazen buis. En roer op vier graden Celsius 's nachts.
Om te beginnen dialyse, voeg eerst 50 gram adsorberde kralen tot 800 milliliter dubbel gedestilleerd water. En gebruik een magnetische roerder om te roeren voor een minuut. Wacht 15 minuten tot de kralen zich vestigen en decanteer de supernatant.
Herhaal de procedure met vooraf gekoelde PBS. Voorwett dialysecassettes in PBS. Gebruik een spuit om het eerder bereide mengsel in de cassettes toe te voegen volgens de instructies van de fabrikant.
Voeg de met PBS behandelde adsorberende kralen toe aan drie liter PBS en plaats de cassettes in de PBS om te dialyseren bij vier graden Celsius. De kralen houden de dichtheidsgradiënt langs het dialysemembraan constant. Verander de buffer en de kralen na een uur en twee uur.
Haal na 24 uur met een spuit de oplossing uit de cassette in een 1,5 milliliter reactiebuis om de gereconstitueerde HDL-deeltjesoplossing terug te krijgen. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Lever inert gas aan de reactiebuis, verzegel het en bewaar de gereconstitueerde HDL-deeltjesoplossing onder inerte gasatmosfeer bij vier graden Celsius.
Bereid eerst een verse spermaoplossing van 30 millimolar voor in RNAse-vrij water. Meng 100 microliter van 10 micromolar synthetisch microRNA met 100 microliter spermaoplossing in een twee milliliter reactiebuis. En 30 minuten uitbroeden bij 30 graden Celsius.
Voeg vervolgens 100 microliter DMSO en 1,2 milliliter 1X LDL-buffer toe aan de bereide microRNA-zaadoplossing. Verdun eerder geprepareerde LDL-deeltjesoplossing met PBS tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer vier milligram per milliliter. Trek vervolgens 450 microliter van de verdunde oplossing in een reactiebuis van 1,5 milliliter en meng met 50 microliter 10X LDL-buffer.
Broed het 10 minuten op ijs. Combineer na incubatie de LDL-deeltjesoplossing van 500 microliter en de 1,5 milliliter microRNA-spermine-DMSO-oplossing en ontcubeer deze gedurende twee uur bij 40 graden Celsius. Voer dialyse vergelijkbaar uit zoals eerder beschreven en bewaar de gelabelde LDL-deeltjesoplossing onder inerte gasatmosfeer op vier graden Celsius.
Verdun de HDL- of LDL-deeltjesoplossing in PBS tussen één-op-100 en één-op-1,000. Kleef mica door plakband tegen het mica-substraat te drukken en de tape eraf te trekken om de bovenste micalagen te verwijderen. Gebruik een pipet om twee microliters te deponeren op vers gespleten mica om vijf minuten in te broeden.
Lipoprotein deeltjes hebben de neiging om continue binding membranen vormen op oppervlakken. Daarom is het belangrijk om de deeltjesconcentratie op het micaoppervlak aan te passen om individuele te krijgen. Na incubatie het monster spoelen met PBS.
Vul de snelle AFM-vloeistofcel met PBS en monteer de mica-dragende scanner op het snelle AFM-podium. In de besturingssoftware start u het benaderproces van de cantilever naar het mica-oppervlak. Gebruik scanformaten van minder dan één vierkante micrometer en houd de beeldkrachten zo laag mogelijk.
Afbeelding van het voorbeeld in de tikmodus. Laad de gegevens in de Gwyddion en detecteer de deeltjes via de merkkorrels per drempelfunctie. Pas de hoogtedrempelwaarde aan om de afzonderlijke deeltjes te maskeren.
Meestal is een niveau rond de 50%een goed uitgangspunt. Verwijder polynomiale achtergrond om de afbeelding af te vlakken en activeer de optie Gemaskerd gebied uitsluiten. Exporteer de maximale hoogtewaarden van de gedetecteerde deeltjes met behulp van de verdeling van de functie Verschillende korrelkenmerken en herhaal deze stappen voor alle opgenomen beelden.
In dit experiment werd de reconstructie van HDL-deeltjes uitgevoerd door delipidatie van HDL-deeltjes, gevolgd door relipidatie en dialyse. Een opbrengst van 50% van de gereconstitueerde HDL-deeltjes kan worden bereikt. Dezelfde etikettering met microRNA was echter niet haalbaar voor de etikettering van LDL-deeltjes, vanwege de hydrofobeiteit van het apolipoproteïne B100-eiwit.
Zo werd DMSO gebruikt voor de penetratie van de lipidemonolaag van de LDL-deeltjes, met een opbrengst van bijna 100%Tijdens de kwaliteitscontrole is de verdunning cruciaal voor analyse. Het bovenste beeld toont een te hoge deeltjesdichtheid. Het onderste beeld is geschikt voor analyse.
De functies van de waarschijnlijkheidsdichtheid van deeltjeshoogten werden berekend voor vergelijking van groottedistributies van de inheemse, gelabelde, en gelabelde controlelipoproteindeeltjes. De relatieve verandering voor en na de etiketteringsprocedure is verwaarloosbaar. Bij het hanteren van RNA oligonucleotiden, werken RNAse-vrij.
Gebruik verse wegwerp plastic verbruiksartikelen, en draag altijd handschoenen. Gebruik alleen nuclease-vrije oplossingen. High-speed AFM is slechts een methode om de algemene vorm van lipoproteïnen te bepalen.
Een alternatieve methode zou elektronenmicroscopie zijn. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een rookkap tijdens het hanteren van diethylether.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
