Biochemistry
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MicroRNA के साथ देशी Lipoprotein कणों का संवर्धन और उनके निरपेक्ष के बाद दृढ़ संकल्प/
Chapters
Summary May 9th, 2019
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यहां, एक मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन आधारित प्रोटोकॉल के निर्धारण के लिए प्रस्तुत किया जाता है देशी माइक्रो-आरएनए सामग्री लिपोप्रोटीन कणों की (निरपेक्ष/रिश्तेदार) । इसके अलावा, माइक्रो-आरएनए स्तर को बढ़ाने के लिए एक विधि, साथ ही लिपोप्रोटीन कणों के सेलुलर तेज दर का निर्धारण करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया है ।
Transcript
लिपोप्रोटीन कण देशी परिवहन वाहन हैं। विदेशी पदार्थों के संवर्धन ट्रैक वाहक के रूप में उनके उपयोग की सुविधा । अणुओं या पूरे कणों की विशिष्ट लेबलिंग सेलुलर तेज को मापने के लिए संभव बनाती है।
संवर्धन के लिए दो तरीकों का उपयोग करने के लिए त्वरित और आसान कर रहे हैं, और पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । प्रक्रिया का प्रदर्शन मारकस एक्समैन और एंड्रियास कर्नर, मेरी प्रयोगशाला से दो पोस्टडॉक्स होंगे। एक धुएं के हुड में परिसीमन शुरू करने के लिए, एक शंकुकेंद्री ट्यूब में इथेनॉल डायथाइल ईथर के पूर्व-कूल्ड तीन-टू-दो मिश्रण के साथ एचडीएल कणों के पांच मिलीग्राम वाले तैयार एचडीएल समाधान के एक से दो मिलीलीटर मिलाएं।
नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट । नकारात्मक 10 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2500 बार जी पर सेंट्रलाइज। सुपरनैट को त्यागें, पूर्व-कूल्ड इथेनॉल डाइथाइल ईथर मिश्रण के 50 मिलीलीटर में गोली को फिर से रखें, और भंवर संक्षेप में।
नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए एक दूसरी बार इनक्यूबेट । सेंट्रलाइज फिर से नकारात्मक 10 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २५०० बार जी पर । फिर गोली को सुखाने के लिए नाइट्रोजन गैस प्रवाह की आपूर्ति करने वाले ट्यूबिंग डालें।
और इसे बफर ए के 250 माइक्रोलीटर में फिर से खर्च करें ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख या किसी अन्य उपयुक्त का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें। इथेनॉल डाइथाइल ईथर मिश्रण के किसी भी अवशेष को हटाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ये सॉल्वैंट्स एपपॉलिटोप्रोटीन के पुनर्पिणीकरण को रोकेंगे। इसके बाद, बफर ए के 250 माइक्रोलीटर प्रति प्रोटीन के एक मिलीग्राम की अंतिम एकाग्रता को पतला करें ट्यूब में समाधान भाग में निष्क्रिय गैस की आपूर्ति करने वाला टयूबिंग डालें।
यदि आवश्यक हो, तो निष्क्रिय गैस वातावरण के तहत रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर करें। पुनर्गठन शुरू करने के लिए, एक साफ ग्लास ट्यूब में, सीओ के 100 माइक्रोलीटर, सी के 13.5 माइक्रोलीटर और पीसी के 500 माइक्रोलीटर मिलाएं। फिर एक सजातीय सतह परत उपज के लिए मिश्रण को सुखाने के लिए ट्यूब के अंदर नाइट्रोजन गैस फ्लश करते समय ग्लास ट्यूब को घुमाएं। 0.5 मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब में, बफर ए में एक ताजा 30-मिलीमोलर स्पर्मीन समाधान तैयार करें। इसके बाद दो मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब में स्पर्मीन सॉल्यूशन के 100 माइक्रोलीटर के साथ 10 माइक्रोलीटर 10 माइक्रोलीटर मिलाएं।
और 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट । इसके बाद, तैयार पीसी-सीओ-सी मास्टरमिक्स सतह परत को फिर से हाइड्रेट करने के लिए इनक्यूबेटेड 200-माइक्रोलीटर समाधान को ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें। और फिर एक मिलीलीटर सोडियम deoxycholate समाधान प्रति एक 30 मिलीग्राम के ५० माइक्रोलीटर जोड़ें ।
दो घंटे तक चार डिग्री सेल्सियस पर हिलाओ। उसके बाद, ग्लास ट्यूब में परिसीमन एचडीएल समाधान के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें। और रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर हलचल ।
डायलिसिस शुरू करने के लिए, पहले 800 मिलीलीटर डबल-डिस्टिल्ड पानी में 50 ग्राम एसोरबेंट मोतियों को जोड़ें। और एक मिनट के लिए हलचल करने के लिए एक चुंबकीय उभारने वाला का उपयोग करें। मोतियों को व्यवस्थित करने के लिए 15 मिनट प्रतीक्षा करें, और सुपरनैंट को डिकंट करें।
पूर्व-कूल्ड पीबीएस के साथ प्रक्रिया दोहराएं। पीबीएस में प्री-वेट डायलिसिस कैसेट। निर्माता के निर्देशों के अनुसार कैसेट में पहले से तैयार मिश्रण को जोड़ने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें।
पीबीएस-इलाज एसोरबेंट मोतियों को तीन लीटर पीबीएस में जोड़ें, और कैसेट को चार डिग्री सेल्सियस पर डायलाइज करने के लिए पीबीएस में रखें। मोती डायलिसिस झिल्ली के साथ घनत्व ढाल स्थिर रखते हैं। एक घंटे और दो घंटे के बाद बफर और मोतियों को बदलें।
24 घंटे के बाद, एक सिरिंज के साथ, पुनर्गठित एचडीएल कण समाधान को ठीक करने के लिए कैसेट से 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में समाधान निकालें। ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें। प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए निष्क्रिय गैस की आपूर्ति, यह सील, और चार डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय गैस वातावरण के तहत पुनर्गठित HDL कण समाधान की दुकान ।
सबसे पहले, आरएनएई-मुक्त पानी में एक ताजा 30-मिलीमोलर शुक्राणु समाधान तैयार करें। दो मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब में स्पर्मिन सॉल्यूशन के 100 माइक्रोलीटर के साथ सिंथेटिक माइक्रोआरएनए के 10 माइक्रोमॉलर के 100 माइक्रोलीटर मिलाएं। और 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
फिर तैयार माइक्रोआरएनए स्पर्मिन समाधान में डीएमएसओ के 100 माइक्रोलीटर और 1X एलडीएल बफर के 1.2 मिलीलीटर जोड़ें। पीबीएस के साथ पहले से तैयार एलडीएल कण समाधान को लगभग चार मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें। फिर पतला समाधान के 450 माइक्रोलीटर को 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में आकर्षित करें, और 10X एलडीएल बफर के 50 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं।
इसे बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, 500-माइक्रोलिटर एलडीएल कण समाधान और 1.5 मिलीलीटर माइक्रोआरएनए-स्पर्मिन-डीएमएसओ समाधान को मिलाएं, और इसे दो घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पहले वर्णित डायलिसिस समान करें, और चार डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय गैस वायुमंडल के तहत लेबल एलडीएल कण समाधान स्टोर करें।
शुरू करने के लिए, पीबीएस में एचडीएल या एलडीएल कण समाधान को एक-से-100 और वन-टू-1, 000 के बीच पतला करें। अभ्रक सब्सट्रेट के खिलाफ चिपकने वाला टेप दबाकर, और ऊपरी अभ्रक परतों को हटाने के लिए टेप को खींचकर क्लीव अभ्रक। पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए हौसले से क्लीव्ड अभ्रक पर दो माइक्रोलीटर जमा करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
लिपोप्रोटीन कण सतहों पर निरंतर बंधन झिल्ली बनाते हैं। नतीजतन, व्यक्तिगत लोगों को प्राप्त करने के लिए अभ्रक सतह पर कण एकाग्रता को समायोजित करना महत्वपूर्ण है। इनक्यूबेशन बाद पीबीएस के साथ सैंपल खंगाल डाला।
पीबीएस के साथ हाई-स्पीड एएफएम लिक्विड सेल भरें, और हाई-स्पीड एएफएम स्टेज पर अभ्रक-ले जाने वाले स्कैनर को माउंट करें । नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, अभ्रक सतह के लिए कैंटिलीवर की दृष्टिकोण प्रक्रिया शुरू करें। एक वर्ग माइक्रोमीटर से कम स्कैन आकार का उपयोग करें, और इमेजिंग बलों को यथासंभव कम रखें।
टैपिंग मोड में नमूना छवि। डेटा को Gwyddion में लोड करें, और दहलीज फ़ंक्शन द्वारा मार्क अनाज के माध्यम से कणों का पता लगाएं। व्यक्तिगत कणों को मुखौटा करने के लिए ऊंचाई सीमा मूल्य को समायोजित करें।
आमतौर पर, 50% के आसपास का स्तर एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। छवि को समतल करने के लिए पॉलीनोमियल पृष्ठभूमि निकालें, और नकाबपोश क्षेत्र विकल्प को सक्रिय करें। विभिन्न अनाज विशेषताओं के वितरण का उपयोग करके पता लगाया कणों की अधिकतम ऊंचाई मूल्यों का निर्यात करें, और सभी दर्ज छवियों के लिए इन चरणों को दोहराएं।
इस प्रयोग में एचडीएल कणों का पुनर्गठन एचडीएल कणों के परिसीमन के माध्यम से किया गया, जिसके बाद पुनर्पीडेशन और डायलिसिस किया गया । पुनर्गठित एचडीएल कणों की 50% की उपज प्राप्त की जा सकती है। हालांकि, माइक्रोआरएनए के साथ एक ही लेबलिंग, एपोलीपोप्रोटीन बी 100 प्रोटीन की हाइड्रोफोबिकिटी के कारण एलडीएल कणों की लेबलिंग के लिए संभव नहीं था।
इस प्रकार, डीएमएसओ का उपयोग एलडीएल कणों के लिपिड मोनोलेयर के प्रवेश के लिए किया गया था, जिसमें गुणवत्ता नियंत्रण के दौरान 100% के करीब उपज थी, कमजोर पड़ने विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। शीर्ष छवि एक बहुत अधिक कण घनत्व से पता चलता है । नीचे की छवि विश्लेषण के लिए उपयुक्त है।
कण ऊंचाइयों के संभावना घनत्व कार्यों की गणना देशी, लेबल और लेबल वाले नियंत्रण लिपोप्रोटीन कणों के आकार वितरण की तुलना के लिए की गई थी। लेबलिंग प्रक्रिया से पहले और बाद में सापेक्ष परिवर्तन उपेक्षा योग्य है। आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को संभालते समय, आरएनएई-मुक्त काम करें।
ताजा डिस्पोजेबल प्लास्टिक उपभोग्य सामग्रियों का उपयोग करें, और हमेशा दस्ताने पहनें। केवल नाभिक मुक्त समाधान का उपयोग करें। हाई-स्पीड एएफएम लिपोप्रोटीन के सामान्य आकार को निर्धारित करने के लिए सिर्फ एक विधि है।
एक वैकल्पिक विधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी होगी। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें, और डायथाइल ईथर से निपटने के दौरान एक धुएं हुड में काम करें।
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