Biochemistry
This content is Open Access.
![Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase](https://cloudfront.jove.com/files/thumbs/55858_t.png)
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Berikelse av Native lipoprotein partikler med microRNA og påfølgende fastsettelse av deres Absolute/relative microRNA innhold og deres Cellular overføringshastighet
Chapters
Summary May 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenteres en kvantitativ sann tids polymerase kjede reaksjons BAS ert protokoll for fastsettelse av det opprinnelige mikro-RNA-innholdet (absolutt/relativ) av lipoprotein-partikler. I tillegg er en metode for å øke Micro-RNA nivå, samt en metode for å bestemme den cellulære opptaket rate av lipoprotein partikler, demonstrert.
Transcript
Lipoproteinpartikler er innfødte transportkjøretøy. Berikelsen av fremmede stoffer letter bruken som sporbærer. Spesifikk merking av molekyler eller hele partikler gjør det mulig å måle det cellulære opptaket.
De to metodene for berikelse er raske og enkle å bruke, og kan tilpasses et bredt spekter av stoffer. Å demonstrere prosedyren vil være Markus Axmann og Andreas Karner, to postdoktorer fra laboratoriet mitt. For å begynne delipidering i en røykhette, bland en til to milliliter tilberedt HDL-løsning som inneholder fem milligram HDL-partikler med 50 milliliter forhåndskjølt tre-til-to-blanding av etanolbenyliseringsmiddel i et konisk sentrifugeringsrør.
Inkuber i to timer ved negative 20 grader Celsius. Sentrifuge ved 2500 ganger g i 10 minutter ved negativ 10 grader Celsius. Kast den supernatante, resuspend pellet i 50 milliliter av pre-avkjølt etanol dietyleter blanding, og vortex kort.
Inkuber en gang til i to timer ved negative 20 grader Celsius. Sentrifuge igjen på 2500 ganger g i 10 minutter ved negative 10 grader Celsius. Sett deretter inn rør som leverer nitrogengassstrøm for å tørke pelleten.
Og resuspend det i 250 mikroliter buffer A.Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford protein analyse eller en annen passende. Det er viktig å fjerne eventuelle rester av etanol dietyliserblandingen, da disse løsemidlene ville hemme relipidation av apolipoproteiner. Deretter fortynnes til en endelig konsentrasjon på ett milligram protein per 250 mikroliter buffer A.Sett inn en slange som leverer inert gass inn i løsningsdelen i røret.
Om nødvendig, lagre løsningen over natten på fire grader Celsius under inert gass atmosfære. For å begynne rekonstituering, bland 100 mikroliter co, 13,5 mikroliter C og 500 mikroliter PC i et rent glass. Roter deretter glassrøret mens du spyler nitrogengass inne i røret for å tørke blandingen for å gi et homogent overflatelag. I et 0,5-milliliter reaksjonsrør, lag en frisk 30-millimolar sperminløsning i buffer A.Bland deretter 100 mikroliter med 10 mikromos syntetiske microRNA med 100 mikroliter sperminløsning i et to milliliter reaksjonsrør.
Og inkuber i 30 minutter ved 30 grader Celsius. Deretter overfører du den inkuberte 200-mikroliteroppløsningen til glassrøret for å rehydrere det tilberedte PC-CO-C mastermix overflatelaget. Og legg deretter til 50 mikroliter av en 30 milligram per milliliter natriumdeoksykollatløsning.
Rør ved fire grader Celsius i to timer. Deretter legger du til 250 mikroliter av den deliperte HDL-løsningen i glassrøret. Og rør på fire grader Celsius over natten.
For å begynne dialyse, legg først til 50 gram adsorbentperler til 800 milliliter dobbeltdestillert vann. Og bruk en magnetisk rører til å røre i ett minutt. Vent 15 minutter for perlene å bosette seg, og dekantere det overnaturlige.
Gjenta prosedyren med forhåndskjølt PBS. Pre-våt dialyse kassetter i PBS. Bruk en sprøyte til å legge den tidligere tilberedte blandingen i kassettene i henhold til produsentens instruksjoner.
Tilsett PBS-behandlede adsorbentperler til tre liter PBS, og legg kassettene i PBS for å dialyze ved fire grader Celsius. Perlene holder tettheten gradient langs dialysemembranen konstant. Endre bufferen og perlene etter en time og to timer.
Etter 24 timer, med en sprøyte, trekker du oppløsningen fra kassetten til et reaksjonsrør på 1,5 milliliter for å gjenopprette den rekonstituerte HDL-partikkeloppløsningen. Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-analysen. Tilsyne inert gass til reaksjonsrøret, forsegle den og lagre den rekonstituerte HDL-partikkelløsningen under inert gassatmosfære ved fire grader Celsius.
Først, forberede en frisk 30-millimolar spermin løsning i RNAse-fritt vann. Bland 100 mikroliter med 10 mikromos syntetisk microRNA med 100 mikroliter sperminløsning i et to milliliter reaksjonsrør. Og inkuber i 30 minutter ved 30 grader Celsius.
Tilsett deretter 100 mikroliter DMSO og 1,2 milliliter 1X LDL-buffer til den tilberedte microRNA-sædinløsningen. Fortynn tidligere forberedt LDL partikkeloppløsning med PBS til en endelig konsentrasjon på ca. fire milligram per milliliter. Trekk deretter 450 mikroliter av den fortynnede oppløsningen inn i et reaksjonsrør på 1,5 milliliter, og bland med 50 mikroliter 10X LDL-buffer.
Inkuber den i 10 minutter på is. Etter inkubasjon kombinerer du 500 mikroliter LDL-partikkelløsningen og den 1,5 milliliter mikroRNA-spermine-DMSO-løsningen, og inkuberer den i to timer ved 40 grader Celsius. Utfør dialyse på samme måte som tidligere beskrevet, og oppbevar den merkede LDL-partikkeloppløsningen under inert gassatmosfære ved fire grader Celsius.
Til å begynne med fortynnes HDL- eller LDL-partikkeloppløsningen i PBS mellom en til 100 og en-til-1 000. Cleave glimmer ved å trykke tape mot glimmerunderlaget, og trekke båndet av for å fjerne de øvre glimmerlagene. Bruk en pipette til å deponere to mikroliter på nyklyst glimmer for å inkubere i fem minutter.
Lipoproteinpartikler har en tendens til å danne kontinuerlige bindingsmembraner på overflater. Derfor er det viktig å justere partikkelkonsentrasjonen på glimmeroverflaten for å få individuelle. Etter inkubasjon, skyll prøven med PBS.
Fyll høyhastighets AFM-væskecellen med PBS, og monter den glimmerbærende skanneren til høyhastighets AFM-fasen. I kontrollprogramvaren starter du tilnærmingsprosessen til cantilever til glimmeroverflaten. Bruk skannestørrelser som er mindre enn ett kvadratisk mikrometer, og hold bildekreftene så lave som mulig.
Bilde av eksemplet i tappemodus. Last dataene inn i Gwyddion, og oppdage partiklene via markkornene etter terskelfunksjon. Juster høydeterskelverdien for å maskere de enkelte partiklene.
Vanligvis er et nivå rundt 50%et godt utgangspunkt. Fjern polynom bakgrunn for å flate bildet, og aktiver alternativet Utelat maskert område. Eksporter de maksimale høydeverdiene til de oppdagede partiklene ved hjelp av fordelingen av ulike kornegenskaper funksjon, og gjenta disse trinnene for alle innspilte bilder.
I dette eksperimentet ble rekonstituering av HDL-partikler utført ved delipidering av HDL-partikler, etterfulgt av relipidation og dialyse. Et utbytte på 50% av rekonstituerte HDL-partikler kan oppnås. Den samme merkingen med microRNA var imidlertid ikke mulig for merking av LDL-partikler, på grunn av hydrofobiiteten til apolipoproteinet B100 protein.
Dermed ble DMSO brukt til penetrasjon av lipidmonolaget til LDL-partiklene, med et utbytte nær 100%Under kvalitetskontroll er fortynningen kritisk for analyse. Det øverste bildet viser en for høy partikkeltetthet. Det nederste bildet er egnet for analyse.
Sannsynlighetstetthetsfunksjoner av partikkelhøyder ble beregnet for sammenligning av størrelsesfordelinger av de innfødte, merkede og merkede kontroll lipoproteinpartikler. Den relative endringen før og etter merkingsprosedyren er forsømt. Når du håndterer RNA oligonucleotides, må du arbeide RNAse-fri.
Bruk ferske engangsplastforbruk, og bruk alltid hansker. Bruk bare kjernefrie løsninger. Høyhastighets AFM er bare én metode for å bestemme den generelle formen på lipoproteiner.
En alternativ metode ville være elektronmikroskopi. Bruk egnet personlig verneutstyr, og arbeid i en røykhette mens du håndterer dietyleter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
