Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
الكشف عن وتوصيف البروتين التجميع الذاتي في الجسم الحي عن طريق قياس التدفق
Chapters
Summary July 17th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
توضح هذه المقالة بروتوكول قياس التدفق المستندة إلى FRET لتحديد حجم التجميع الذاتي للبروتين في كل من خلايا S. cerevisiae و HEK293T.
Transcript
فهم الأساس المادي للتجميع الذاتي للبروتين في الخلايا محدود بسبب عدم وجود الأدوات المناسبة. الأساليب الحالية تعاني من حساسية منخفضة، قراءات غير مباشرة، الإنتاجية محدودة و/أو دقة مستوى السكان. في المقابل، يكشف مقايستنا ويحسب كمي ميل البروتين للتجميع الذاتي في الجسم الحي مع حساسة، خلية واحدة، عالية الإنتاجية readout بغض النظر عن توطين البروتين أو القابلية للذوبان.
عند محاولة أول اختبار ، والحصول على حق تحويل الصورة قد تتطلب بعض التجارب التجريبية للحصول على الظروف المثلى لتحقيق قراءات جيدة عبر لوحة كاملة. كما يمكن أن تتعرض حساسية المقايسة للخطر إذا لم يكن مقياس القدرة على اكتشاف الفلاتر المنفصلة لإشارات فريت والمقبِل. إثبات الإجراء معي سيكون أندرو بوكس، مدير مختبر نواة استئصال الدراجات.
لإعداد ثقافة الخميرة لDAmFRET ، لكل بروتين الاستعلام ، تلقيح مستعمرات الخميرة المحولة في ثلاثية في 200 ميكرولترات من وسيلة مناسبة للنمو غير المحفزة في الآبار الفردية من 96 بئر جولة أسفل لوحة الثقافة. احتضان خلايا الخميرة مع اهتزاز مع مدار 1.5 ملليمتر في 1، 200 دوران في الدقيقة الواحدة في 30 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. في نهاية الحضانة، رواسب خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي وإزالة االنسابات عن طريق انقلاب قوية.
إضافة 200 ميكرولترات من وسيلة التعريفي المناسبة وإعادة الخلايا إلى حاضنة اهتزاز لمدة 12 ساعة أخرى. في نهاية الحضانة ، تترسب خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي والانعكاس القوي ، ثم إضافة 200 ميكرولترات من وسيط الحث الطازج. ثم احتضان الخلايا مع اهتزاز لمدة أربع ساعات إضافية للحد من فلورانس السيارات.
لصور تحويل العينات، ضع اللوحة بدون الغطاء تحت مصباح فوق البنفسجية مزودة بمصفاة نانومتر 320 إلى 500 و collimator شعاع وضعها 45 سم فوق لوحة. بدوره على مصباح الصورة لتحويل الخلايا لمدة 25 دقيقة مع اهتزاز. لجمع البيانات DAmFRET، قم بتحميل الخلايا المحولة من الصور على مقياس تدفق الصور مع ليزر غير كولينيار 488 و 561 نانومتر وبوابة أربع خلايا غير مضافة واحدة عن طريق الدوران العالي ومنطقة خلية صغيرة.
ثم جمع البيانات لمدة 2-5 مرات 10 إلى أربع خلايا واحدة لكل عينة داخل بوابة إيجابية fluorescence. في نهاية التحليل، استخدم عينة mEos 3.1 غير الصورة للإشارة المانحة الصرفة وDsRed أحادية الأحرف اثنين لإشارة المقبول النقي لتعيين التعويض. لمزيد من الحساسية، تأكد من أن قناة كاشف فريت تعتبر أيضاً كهدف غير مباشر في برنامج التحليل.
حساب المعلمة AmFRET كنسبة من إشارة FRET الإجمالي مقسوما على إشارة قبول FRET المجموع. ملامح AmFRET من خلايا الخميرة التي تعبر عن البروتين الفلورسنت وحدها تظهر AmFRET لا تذكر في حين أن خلايا الخميرة التي تعبر عن homooligomer مستقرة تنصهر على البروتين الفلورسنت تظهر قيم إيجابية موحدة AmFRET. صور الخلايا التي حصلت عليها عملية تدفق الخلايا التي يتم التقاطها من خلال التصوير تكشف عن الفلورسيه المنتشرة في جميع القنوات.
يُظهر المجهر المجهري من رصاة Z لحقول متعددة من الخلايا توزيعًا موحدًا للفلوروس في جميع أنحاء الزل في كل خلية بدون بونكتا يمكن اكتشافها. خلايا الخميرة التي تعبر عن الفلوروفور وحدها أو الفلوروفور بالإضافة إلى شكل متحول من بروتين التهاب الإنسان تظهر AmFRET لا تذكر على نطاق التركيز بأكمله مما يدل على عدم القدرة على التفاعل الذاتي. وعلى النقيض من ذلك، فإن البروتين الملتهب من النوع البري يوضح ملف DAmFRET مع عدد واحد لا يذكر من AmFRET وواحد من سكان AmFRET عالية.
لاحظ أن البروتين الملتهب من النوع البري يقاوم التجميع الذاتي حتى في تركيزات عالية مع تحول البروتين إلى شكل تجميع ذاتي في جزء صغير فقط من الخلايا. وهذا مؤشر واضح على وجود حاجز نواتية أمام التجمع الذاتي. كما أكد التصوير المفلور، تمثل هذه التجمعات الخلايا التي تحتوي على البروتين القابل للذوبان فقط أو البروتين المجمع ذاتياً في الغالب على التوالي.
في الواقع، يؤكد DAmFRET البيانات الهيكلية السابقة أن النقطة متحولة في الملتهب يعطل النوى عبر التركيزات التي يمكن تحقيقها من قبل هذا النظام التعبير. لاحظ أن ملامح التعبير البروتين في خلايا الثدييات التي تفتقر إلى تعبير كاسباس-1 تشبه تلك التي لوحظت في خلايا الخميرة. أهم خطوة يجب تذكرها هي تحويل الصور.
وتشمل الخطوات الحاسمة الأخرى جمع عدد كاف من الأحداث التي لا تشبع لإشارة الفلوريسنس والحصول على التعويض الصحيح. متابعة الفحص مع الكيمياء الحيوية المناسبة، وطفرات عقلانية وأساليب البيولوجيا الهيكلية يمكن أن تساعد على توضيح آلية التجميع الذاتي بشكل كامل.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
