تحديد كثافة القناة الصفراوية في كبد الفأر

الشجرة الصفراوية هي جزء حاسم من كبد الثدييات، مما يسمح بمرور الصفراء من خلايا الكبد إلى الأمعاء. تتشكل القنوات الصفراوية داخل الكبد (BDs) من قبل الخلايا الأقنية الصفراوية، والتي تميز عن الخلايا الكبدية ثنائية القدرة من خلال الشق وTGFβ إشارة^1،2. المواصفات المناسبة والالتزام من الخلايا الصفراوية وتجميعها في BDs ناضجة حاسمة لتطوير شجرة الصفراوية داخل الكبد. كما ينمو الكبد أثناء النمو أو عند تجديد الجهاز، يحتاج النظام الصفراوية لتطوير على طول الكبد لضمان الصرف الصفراويالسليم. وعلاوة على ذلك، فإن عددا من الأمراض المتلازمية وغير المتلازمية تؤدي إلى ندرة الـ BDs intrahepatic³. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي عدد من أمراض الكبد الحادة والمزمنة إلى ما يسمى بردود الفعل القنواتية في الكبد، والتي تعرف بأنها وجود عدد كبير من الخلايا التي تعبر عن علامات الصفراوية ولكنها لا تنشأ بالضرورة من الخلايا الصفراوية أو الشكل براءة اختراعBDs 4. في اضطراب متعدد الأنظمة متلازمة ألاجيل (ALGS)، haploinsufficiency من ligand الشق jagged1 (JAG1) يؤدي إلى تشكيل BD الفقراء وركود صفراوي^5،6. وقد أثبت مختبرنا مؤخرًا أن خط الماوس Jag1 heterozygous^الذي تم إنشاؤه سابقًا هو نموذج حيواني لندرة BD في ALGS⁸. في هذا النموذج الماوس من ALGS، الخلايا الأقنية لا تزال موجودة. ومع ذلك، فإنها تفشل في الالتزام بالاندماج في ناضجة، وبراءات الاختراع BDs⁸. ولذلك، فإن تحليل الكبد في نموذج من ندرة BD يتطلب أكثر من وجود واضح أو غياب الخلايا الأقنية. من المهم تقييم درجة وجود الـ BDs الناضجة في الكبد بدقة.

في علم الأمراض التشريحية ، هناك طرق كمية مقبولة لتقييم ما إذا كان هناك ندرة BD⁹. على سبيل المثال، الدراسات على ALGS في المرضى البشر غالبا ما تحدد درجة BD إلى نسبة الوريد المدخل (PV) عن طريق تحليل ما لا يقل عن 10 أوعية المدخل لكل خزعة الكبد^9،10. تحليل شكل والحضور العام أو عدم وجود BDs براءات الاختراع، جنبا إلى جنب مع كيمياء المصل، يمكن أن توفر معلومات قيمة عن تطوير BD في الفئران^11،12،13. ومع ذلك، يمكن أن تفقد الفئران عددا كبيرا من BDs مع زيادة متواضعة فقط في مستوى البيليروبين المصل⁸. وبناء على ذلك، فإن الطريقة الكمية التي تقيّم عدد الـ BDs الموجودة لكل PV يمكن أن توفر مقياساً مباشراً أكثر لدرجة ندرة BD في الفئران. في تقرير صدر مؤخرا، قمنا بتحديد عدد BDs لكل PV عبر جميع فصوص الكبد وأبلغنا عن انخفاض كبير في نسبة BD إلى PV في Jag1 +/– الحيوانات⁸. خلال تحليلنا، لاحظنا أنه على الرغم من التباين الكبير في درجة الاستجابة الالتهابية وردود الفعل القنواتية، فإن نسبة BD إلى PV لا تظهر الكثير من التباين⁸. وعلاوة على ذلك، فإن التحديد الكمي لنسبة BD إلى PV سمح لنا بإثبات أن إزالة نسخة واحدة من جين جليكوسيلترانسفيراز Poglut1 في Jag1+/– يمكن للالحيوانات أن تحسن بشكل كبير من ندرة BD⁸. في خلفية Jag1+/+ ، يؤدي فقدان Poglut1 المشروط في خلايا العضلات الملساء الوعائية إلى زيادة تدريجية في أعداد BD، وهو أمر متواضع (20-30٪) في P7 ولكن يصبح بارزا في البالغين⁸. مرة أخرى، سمحت لنا هذه التقنية لإظهار أنه حتى في P7، فإن الزيادة في كثافة BD في هذه الحيوانات كبيرة إحصائيا. وتجدر الإشارة إلى أن زيادة كثافة BD في هذا النمط الجيني في أربعة أشهر من العمر تم التحقق من صحتها من خلال تحليل الراتنج المدلى بها أيضا. ⁸ هذه الملاحظات وغيرها من التقارير التي تقيس كثافة BD في مختلف نماذج الماوس ALGS^14،15 دفعتنا إلى دمج هذه الطريقة في استراتيجيتنا الشاملة لتحليل العيوب الصفراوية في مختلف المتحولين والفئران المعدلة وراثيا.

هنا، ونحن بالتفصيل تقنية واضحة التي يمكن استخدامها لدراسة درجة ندرة BD في نماذج الماوس من أمراض الكبد (الشكل1). في هذه الطريقة، يتم استخدام التلطيخ المشترك مع علامات الخلايا الصفراوية سيتوكيراتين (CK) 8 و CK19 (فيما بعد CK واسعة الطيف، wsCK) لتصور BDs والخلايا الأقنية غير المدمجة في كبد الماوس. يتم إضافة جسم مضاد ضد أكتين العضلات ألفا الملساء (αSMA) إلى تلطيخ لعلامات السفن. التحليل المنهجي لنسبة BD إلى PV في قسم يغطي جميع فصوص الكبد يضمن تحليل عدد كبير من PVs لكل النمط الجيني. وبما أن أسلوبنا يعتمد على قياس الـ BDs وPVs في الصور ذات الأبعاد الـ 2، فإنه ليس مناسبًا لدراسة آثار طفرة معينة على البنية ثلاثية الأبعاد للشجرة الصفراوية أو سلامة القنوات الصفراوية الصغيرة. ومع ذلك، فإنه يوفر استراتيجية بسيطة وموضوعية للمحققين لتقييم التطور الصفراوية في الماوس.