测定小鼠肝脏中胆管密度

胆道系统是哺乳动物肝脏的重要组成部分，负责将胆汁从肝细胞输送至肠道。肝内胆管（BDs）由胆管细胞构成，这些胆管细胞通过Notch和TGFβ信号通路从双潜能的肝母细胞分化而来^1,2。胆管细胞的正确特化、命运决定及其组装形成成熟的胆管结构，对于肝内胆道系统的发育至关重要。在肝脏发育或器官再生过程中，随着肝脏的生长，胆道系统也必须相应发育，以确保胆汁的正常引流。此外，多种综合征性和非综合征性疾病会导致肝内胆管数量减少³。同时，许多急性和慢性肝病可引发所谓的胆管样反应（ductular reactions），其特征是肝脏中出现大量表达胆管标志物的细胞，但这些细胞并不一定来源于胆管细胞，也不一定形成通畅的胆管结构⁴。在多系统受累的Alagille综合征（ALGS）中，Notch配体Jagged1（JAG1）基因的单倍剂量不足会导致胆管发育不良和胆汁淤积^5,6。我们实验室近期证实，先前构建的Jag1杂合小鼠品系⁷可作为ALGS中胆管稀少的动物模型⁸。在该ALGS小鼠模型中，胆管细胞仍然存在，但无法正常定植并整合为成熟、通畅的胆管结构⁸。因此，在胆管稀少模型中对肝脏进行分析时，仅观察胆管细胞的表观存在与否是不够的，准确评估肝脏中成熟胆管的存在程度尤为重要。

在解剖病理学中，存在公认的定量方法用于评估是否存在胆管稀少（BD paucity）⁹。例如，针对人类患者中阿拉杰里综合征（ALGS）的研究通常通过分析每例肝活检样本中至少10个门静脉结构来量化胆管（BD）与门静脉（PV）的比值^9,10。结合血清生化指标，对开放性胆管的形态及其整体存在与否进行分析，可为小鼠胆管发育情况提供有价值的信息^11,12,13。然而，小鼠可能在血清胆红素水平仅有轻度升高时即丢失大量胆管⁸。因此，一种能够评估每根门静脉所对应的胆管数量的定量方法，可更直接地反映小鼠胆管稀少的程度。在最近的一项研究中，我们量化了所有肝叶中每根门静脉对应的胆管数量，并报道了Jag1+/–动物中胆管与门静脉的比值显著降低⁸。在分析过程中我们注意到，尽管炎症反应和胆管样反应的程度存在显著差异，但胆管与门静脉的比值变异较小⁸。此外，通过对胆管与门静脉比值的定量分析，我们得以证明：在Jag1+/–动物中敲除一个拷贝的糖基转移酶基因Poglut1可显著改善其胆管稀少表型⁸。在Jag1+/+遗传背景下，血管平滑肌细胞中条件性缺失Poglut1会导致胆管数量进行性增加，该变化在出生后第7天（P7）时较为轻微（20–30%），但在成年个体中变得显著⁸。同样，该技术使我们能够证明，即使在P7阶段，这些动物中胆管密度的增加也具有统计学意义。值得注意的是，该基因型在四月龄时胆管密度的增加也通过树脂铸型分析得到了验证⁸。这些观察结果以及其他报道中对不同ALGS小鼠模型胆管密度的测量结果^14,15促使我们将该方法纳入整体策略，用于分析多种突变型和转基因小鼠中的胆道缺陷。

本文详细介绍了一种简单的方法，可用于评估肝病小鼠模型中胆管（BD）缺失的程度（图1）。该方法通过使用胆管细胞标志物——细胞角蛋白（CK）8 和 CK19（下文简称广谱CK，wsCK）进行共染色，以可视化小鼠肝脏中的胆管及未整合的胆管细胞。染色过程中同时加入抗α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体，用于标记血管。通过对涵盖所有肝叶的组织切片进行系统性分析，计算BD与门静脉（PV）的比例，从而确保每种基因型均分析足够数量的PV。由于本方法依赖于在二维图像中对BD和PV进行定量，因此不适用于研究特定突变对胆管树三维结构或细小胆管完整性的影响。尽管如此，该方法仍为研究人员提供了一种简便且客观的策略，用于评估小鼠胆管系统的发育情况。