담즙 나무는 포유류 간에서 중요 한 부분, 창 자에 간 세포에서 담 즙의 통과 허용. 간간 간 담관 (BDs)은 융기양양에 의해 형성되며, 이는 노치 및 TGFβ 신호전달을통해 이중 전위 간폭발과 구별되는 1,2. 성숙한 BD에 담관과 그들의 어셈블리의 적당한 명세서 그리고 투입은 간 간 담즙 나무의 발달을 위해 중요합니다. 간 개발 또는 장기 재생 시 성장, 담 즙 시스템 적절 한 담 즙 배수를 보장 하기 위해 간 따라 개발 해야. 더욱이, 많은 신디로믹 및 비 신드로믹 질환은 간간 BDs3의빈약성을 초래한다. 또한, 다수의 급성 및 만성 간 질환은 담즙 마커를 발현하지만 담즙 세포 또는 형태에서 반드시 발생하지 않는 상당수의 세포의 존재로 정의되는 간에서 소위 연성 반응을 초래합니다. 특허 BDs4. 다중시스템 장애인 알라길증후군(ALGS)에서, 노치 리간드의 하플로인스실핍증1(JAG1)은BD 형성이 불량하고 담즙정체증5,6. 우리의 실험실은 최근에 이전에 생성 된 Jag1 이형 마우스 라인 7이 ALGS 8에서BD 빈곤의 동물 모델임을 입증했습니다. ALGS의 이 마우스 모델에서는 담관옥시트가 여전히 존재합니다. 그러나, 그들은 성숙한 특허 BDs 8에통합을 커밋하지 못합니다. 따라서 BD 빈곤의 모델에서 간을 분석하려면 담관옥시의 명백한 존재 또는 부재 이상이 필요합니다. 성숙한 BDs가 간에서 존재하는 정도를 정확하게 평가하는 것이 중요합니다.

해부학 병리학에서는 BD 빈곤이 존재하는지 여부를 평가하기위한 허용 된 양적 방법이있습니다 9. 예를 들어, 인간 환자에서 ALGS에 대한 연구는 간 생검9,10개당 적어도 10개의 포탈 혈관을 분석하여 BD를 포탈 정맥(PV) 비율로 정량화한다. 혈청 화학과 결합된 특허 BD의 모양 및 전반적인 존재 또는 부재의 분석은 마우스11,12,13에서BD 개발에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있다. 그러나, 마우스는 혈청 빌리루빈 수준 8에 있는 단지 겸손한 증가와BDs의 상당한 수를 분실할 수 있습니다. 따라서, PV당 존재하는 BDs의 수를 평가하는 정량적 방법은 마우스에서 BD 빈곤의 정도를 보다 직접적으로 측정할 수 있다. 최근 보고서에서, 우리는 모든 간 엽에 걸쳐 PV 당 BDs의 수를 정량화하고 Jag1 +/-- 동물8에서PV 비율에 BD에 있는 중요한 감소를 보고했습니다. 분석 과정에서 염증 반응 및 연성 반응의 정도가 현저한 변동에도 불구하고 BD 대 PV 비율은 많은가변성을 나타내지 않는 것으로 나타났습니다 8. 더욱이, BD 대 PV 비율의 정량화는 우리가 Jag1+/-에서 글리코실트랜스퍼라제 유전자 Poglut1의 1개의 사본을제거하는 것이 그들의 BD 빈곤8을 현저하게 향상시킬 수 있다는 것을 입증하는 것을 허용했다. Jag1+/+ 배경에서 혈관 평활근 세포에서 Poglut1의 조건부 손실은 BD 수치의 점진적 인 증가를 초래합니다(20-30%). P7에서 하지만 성인에서 눈에 띄는 된다8. 다시 말하지만, 이 기술은 P7에서도 이러한 동물의 BD 밀도의 증가가 통계적으로 유의하다는 것을 보여줄 수 있었습니다. 참고로, 생후 4개월에 이 유전자형의 증가된 BD 밀도는 수지 주조 분석을 통해서도 검증되었다. 8 다른 ALGS 마우스 모델14,15에서 BD 밀도를 측정한 이러한 관찰 및 기타 보고서는 다양한 돌연변이체의 담즙 결함을 분석하기 위한 전체 전략에 이 방법을 통합하도록 유도했습니다. 및 형질전환 마우스.

여기서, 간 질환의 마우스 모델에서 BD 빈곤의 정도를 검사하는데 사용될 수있는 간단한 기술을 상세히 기술한다(도 1). 이 방법에서, 콜란지오시포르테 마커 시토케라틴(CK) 8 및 CK19(이하 광스펙트럼 CK, wsCK)와 함께 공동 염색하는 것은 마우스 간에서 BD및 통합되지 않은 담관옥을 가시화하는데 사용된다. 알파 평활근 액틴(αSMA)에 대한 항체가 라벨 용기에 염색에 첨가된다. 모든 간 엽을 덮는 단면도에서 BD 대 PV 비율의 체계적인 분석은 각 유전자형에 대해 많은 수의 PV를 분석할 수 있도록 합니다. 우리의 방법은 2D 이미지에서 BD와 PV를 정량화에 의존하기 때문에, 담즙 나무의 3D 구조 또는 작은 담즙 도관의 무결성에 주어진 돌연변이의 효과를 연구하기에 적합하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 마우스에 담즙 발달을 평가하기 위하여 조사자가 간단하고 객관적인 전략을 제공합니다.

이 프로토콜은 조사자가 간 질환의 마우스 모델에서 담관 개발을 정량화 할 수 있게합니다. 그것은 또한 담관 개발에 유전 수정자의 효과 평가에 대 한 허용. 이 기술의 장점은 담관 개발의 직접 평가를 위한 간단하고 민감하며 정량적인 방법이라는 것입니다.

먼저, 포셉에 의해 팽팽하게 피부가 고정되어 있는 가운데, 작은 가위를 사용하여 안락사 된 마우스의 갈비뼈 아래 약 1 인치 의 횡절개를 합니다. 간 의 전체 복부 표면을 노출. 작은 가위를 사용하여 복부에 있는 그밖 기관에 간을 연결하는 인대를 주의 깊게 잘라냅니다.

그런 다음 일반적인 담관을 잘라 내어 장에서 간을 분리합니다. 담낭을 잡고 간을 조심스럽게 제거하십시오. 즉시 4 %의 파라 포름알데히드로 3 분기 가득 50 밀리리터 튜브에 배치합니다.

간 조직을 해결하려면 48 시간 동안 섭씨 4도에서 4 %의 PFA로 배양하십시오. 일련의 에탄올 세척 후, 실온에서 각각 30 분 동안 클리어링 에이전트로 간을 세 번 씻으릅니다. 포함을 시작하려면, 60섭씨까지 예열된 파라핀 왁스에서 30분 동안 티슈 몰드에 티슈 카세트를 세 번 씻는다.

그런 다음, 3 분기 높이에 파라핀 왁스로 조직 금형을 채우고 섭씨 60도에서 가열 블록에 보관하십시오. 복부 쪽이 위로 향하여 금형에 간을 놓습니다. 가열 블록에서 금형을 조심스럽게 제거 한 후, 금형에 카세트의 상단을 배치합니다.

뜨거운 액체 파라핀으로 위로 얹고 밤새 실온으로 식힙니다. 곰팡이에서 간 블록을 제거 한 후, 미세 토메를 사용하여 간 표면 등쪽을 통해 단면화하여 5 마이크로 미터 섹션을 만듭니다. 해부 현미경의 밑에 피상적 인 단면을 확인하여 섹션이 전단되거나 접히지 않았는지 확인하십시오.

면역히스토케작용을 위한 슬라이드를 처리하려면 유전자형당 슬라이드 1개를 선택하고 자일렌, 100% 에탄올, 95%에탄올, 마지막으로 70%에탄올로 분석하여 15분 동안 세척한다. 이온화 된 물에 슬라이드를 세척 한 후, 트리스 기반의 높은 pH 항원 검색 용액에 담급. 그런 다음 평방 인치 당 10 파운드에서 3 분 동안 압력 밥솥에 압력을 가하여 가열하십시오.

슬라이드를 실온으로 식힌 후 PAP 펜을 사용하여 슬라이드의 섹션을 간략하게 설명합니다. PBS Tween으로 세척한 후, 섹션당 블로킹 용액 100마이크로리터를 추가하고 1시간 동안 섭씨 4도에서 배양하여 조직 섹션을 차단합니다. 각 섹션에 3개의 1차 항체를 모두 포함하는