Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie
Chapters
Summary September 5th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.
Transcript
Reactieve zuurstofsoorten of ROS, zijn zeer reactieve zuurstofsoorten die worden geproduceerd door cellen, en beïnvloedt hun gedrag. Hoewel overtollige ROS kan ook leiden tot wijdverbreide cellulaire ravage, en in ernstige gevallen, celdood. Zo is het behoud van ROS homeostase van fundamenteel belang voor cellulaire functie en overleving.
Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, richt zich op het meten van een specifiek type ROS, dat wordt gegenereerd door mitochondriën, voornamelijk als een metabolisch bijproduct in levende, normale of gezonde hematopoietische stam- en voorlopercelpopulaties, evenals in leukemiecellen uit het muismodel van bloedkanker, Acute Myeloïde Leukemie of AML. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te evalueren hoe genetische manipulatie, zoals gendesletie of overexpressie, invloeden mitochondriale ROS in verschillende gezonde en kwaadaardige hematopoietische populaties. En als gevolg daarvan, potentieel inzichtelijke informatie over redux staat en eventueel het metabolisme van de cellen.
Deze techniek machtigt flow regelen metrische analyse van een protogene sonde te controleren mitochondriale ROS productie in levende gezonde en kwaadaardige hematopoietische stengel en voorvader subpopulaties. Dit protocol is eenvoudig en kan in een paar uur worden voltooid. Bovendien is het geschikt voor live celanalyse en maakt het mogelijk om mitochondriale ROS in stamcelpopulatie in het beenmerg te onderscheiden en te analyseren, met behulp van oppervlaktemarkering van kleuring.
Na het verzamelen van mononucleaire beenmergcellen van wilde strakke muizen en leukemische MLL-AF9 muizen, volgens het manuscript, aliquot 200 microliters van de cel suspensie in elk van de negen enkele kleuren controle buizen. Aliquot de resterende cellen in andere experimentele buizen, 200 microliters elk. Plaats vervolgens in een centrifuge twee experimentele buizen met beenmergcellen en leukemische cellen, en een controlebuis.
Centrifuge op 300 keer G gedurende vijf minuten. Vervolgens decanteren de supernatant, en opnieuw op te schorten de cellen in kamertemperatuur F-PBS met een levende / dode cel vlek, volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
Voeg daarna 1 milliliter kamertemperatuur F-PBS toe aan de drie levende/dode gekleurde buizen en één enkele kleurcontrolebuis voor mitochondriale ROS-kleurstof. Plaats de buizen in de centrifuge op 300 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Dan, verkrijg een 5 millimolar mitochondriale ROS kleurstof voorraad oplossing door opnieuw schorsing van 50 microgram mitochondriale ROS kleurstof in 13 microliters van DMSO.
Voeg vervolgens 13 milliliter kamertemperatuur F-PBS toe aan de 13 microliter mitochondriale ROS-kleurstof om te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van vijf micromolar. Voeg indien nodig 13 microliter van 50 millimolar Verapamil toe aan de oplossing om mitochondriale effluxpompen te remmen. Haal de buizen uit de centrifuge en aspirate uit de was van de levende / dode cel vlek.
Voeg 200 microliters F-PBS toe in de live/dode kleuringscontrole en houd het in ijs tot het klaar is om de analyse te starten. Voeg 200 microliters van de mitochondriale ROS kleurstofvlek met Verapamil toe aan elke experimentele buis, evenals de mitochondriale ROS-kleuringsbuis. Vortex te mengen en uitbroeden gedurende 10 minuten op 37 graden Celsius in het donker.
Voeg vervolgens 1 milliliter kamertemperatuur F-PBS toe aan de besturing en experimentele buizen. Vijf minuten centrifugeren bij 300 keer G bij kamertemperatuur. Aspirate uit de supernatent en was de cellen met een extra een milliliter kamertemperatuur F-PBS.
Centrifuge opnieuw gedurende vijf minuten op 300 keer G, bij kamertemperatuur. Bereid eerst twee antilichaamcocktails voor gezonde en leukemie beenmergcellen. Aspirate de supernatant uit de experimentele buis met gezonde beenmergcellen, en voeg 200 microliter van de antilichaam cocktail nummer een aan de buis.
Vortex om te mengen. Bereid ook de single color control tubes voor door 200 microliters van F-PBS en één microliter van het bijbehorende antilichaam toe te voegen. 60 minuten incuberen op ijs in het donker.
Aspirate de supernatant uit de experimentele buis met leukemie beenmerg, en voeg 200 microliters van de antilichaam cocktail nummer twee, aan de buis. Vortex om te mengen. 60 minuten incuberen op ijs in het donker.
Daarna was je alle buizen met 1 milliliter koude F-PBS en centrifuge vijf minuten bij 300 keer G bij kamertemperatuur. Schort de cellen opnieuw op in 500 microliter koude F-PBS. Breng de celsuspensie over in elke stroomcytometerbuis met een filter van 40 micrometer voor het uitsluiten van aggregaten.
Plaats eerst een geen vlek controle buis in de stroom cytometrie machine en start de overname om de stroom cytometrie machine te compenseren. Herhaal dit voor andere controlebuizen. Lees daarna de experimentele buizen om de poorten op te zetten.
Als u de grootte en complexiteit van de celpopulatie wilt analyseren, stelt u eerst voor een gezonde HSPC het voorwaartse spreidingsgebied in en stelt u populaties van het gebied voor spreidingsgebied in. Druk op de Square Gate-knop, om vreemde brokstukken van het voorste en zijverstrooiende perceel te verwijderen. Dan, op een voorwaartse strooigebied en hoogteperceel, gebruik een dubbele discriminator om doubletten uit te gate.
Selecteer levende cellen, afstamming lage cellen, en de verschillende gezonde HSPC. Voor elke populatie van belang, analyseren van de mediane fluorescentie intensiteit van het TRPE-kanaal in een histagram plot, om verschillen in de mitochondriale ROS signaal te evalueren. Herhaal dezelfde procedure van grootteanalyse, gating en histogram plotten voor leukemiepopulaties.
Beenmergcellen geïsoleerd van gezonde muizen werden gekleurd met een levende / dode kleurstof en een mitochondriale ROS kleurstof, en vervolgens gekleurd met antilichamen herkennen afstamming markers: plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 en CD150. Bovendien werden beenmergcellen van leukemiemuizen ook bevlekt met CD45.2 om onderscheid te maken tussen MLL-AF9 leukemiecellen van gezonde beenmergcellen met cd45.1. Een vergelijking van mitochondriale ROS kleuring, tussen gezonde CD48 negatieve LSK, en myeloïde voorlopers, toont aan dat myeloïde voorlopers aanzienlijk hogere niveaus van mitochondriale ROS kleuring vertonen.
Bovendien, c-Kit hoge leukemie voorlopers vertonen aanzienlijk hogere niveaus van mitochondriale ROS kleuring, in vergelijking met c-Kit intermediaire lage leukemie cellen, gezonde CD48 negatieve LSK en myeloïde voorlopers. C-Kit intermediaire lage leukemiecellen, ook weergegeven een aanzienlijk hogere waarde in vergelijking met CD48 negatieve LSK cellen, maar niet aan myeloïde voorlopers. Mitochondriale ROS-kleurstoffen zijn zeer reactief en passende wasstappen zijn nodig om ervoor te zorgen dat een overmaat aan de kleurstof is verwijderd voordat u met de volgende stappen begint.
Er zijn verschillende chemisch verschillende ROS fluorogene kleurstoffen die kunnen worden gebruikt in dit protocol, om een beetje kennis van de redux status in levende hematopoietische cellen te bereiken. Deze techniek is op grote schaal gebruikt in de literatuur, en kan nuttige inzichten geven over de metabole en signalering trajecten die differentieel zijn geregeld in leukemie cellen, in vergelijking met hun normale tegenhangers.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
