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Developmental Biology

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JoVE Journal Developmental Biology

ヒト胚盤胞生検とガラス化

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Journal (Developmental Biology)

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Journal (Developmental Biology)

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

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ヒト胚盤胞生検とガラス化

Article DOI: 10.3791/59625-v

July 26th, 2019 •

Roberta Maggiulli¹, Adriano Giancani^1,2, Danilo Cimadomo¹, Filippo M. Ubaldi¹, Laura Rienzi¹

¹G.EN.E.R.A. Centers for Reproductive Medicine, ²DAHFMO, Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome

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July 26th, 2019

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胚盤胞生検およびガラス化は、移植前遺伝子検査を効率的に行うために必要とされる。5-7日目のゾナ・ペルシダの順次開きと7-8型栄養細胞の検索を伴うアプローチは、必要な操作の数と、最適でない環境条件への胚の暴露の両方を制限する。

Transcript

胚盤胞生検とガラス化の両方がIVFの革命であり、体外受精の両方であり、世界中の胚学者が胚のリスクを最小限に抑えてヒト胚に着床前遺伝子検査を行うことを可能にした。栄養細胞化生検は、完全に成長した胚から約7個の細胞を取り出すことを可能にし、それによって堅牢な下流遺伝子解析を可能にした。さらに、このアプローチに対する影響は、現在までに示されていません。

このワークフローの臨床効率は単因性の状態の患者および彼らの胚盤胞内の染色体異常の危険の高いそれらの患者が着床前の遺伝子検査の恩恵を受けることを可能にする。胚選択の現在の戦略を改善する余地はまだある。例えば、miRNomicおよびプロテオミクスプロファイリングは、単一の栄養補助ダーム生検での着床前遺伝子検査を補完する興味深い選択肢を表す。

経験の浅いオペレーターは、多くの場合、透明帯を開いて貫通することに苦労します。それは単なる焦点の問題です。胚盤胞、レーザー目的、ピペットは同じ焦点面に置く必要があります。

生検皿に患者の詳細を標識した後、永久的な無毒なマーカーで、胚とサイクルIDを備えたHEPES緩衝培地の各10マイクロリットルの低下に数え、300マイクロメートルのストリッピングピペットを使用して、生検皿の最初の一滴に実行可能な完全に拡張された胚盤胞を移し、余分な培地を取り除くためにドロップをすすぐるみ、皿を逆顕微鏡の下に置き、生検皿の3番目の滴から培地で生検ピペットをプライムします。倍率20倍の下で、胚盤胞を配向して7時に内細胞質量の明確なビューを得て、保持ピペット上の胚を固定する。

ピペットと胚盤胞の両方が同じ焦点面にあるように、透明帯に焦点を当てます。レーザーの目的に切り替え、内側の細胞塊の反対側にある透明帯にレーザーポインターを置きます。2~3個のレーザーパルスで透明化した透明帯を掘削し、生検ピペットを透明帯に対して静かに押し付け、侵害を通して媒体を吹き飛ばして、栄養細胞を内部表面から取り外します。

栄養刺激体が剥離したら、穴を通って入り、穏やかな吸引で7〜8個の栄養栄養細胞を生検ピペットに吸い込みます。適度な吸引を適用して標的細胞を伸ばす間、生検ピペットを後方にわずかに動かし、レーザーを吸引細胞の最も薄い部分に向けます。細胞間の接合部で2~5個のレーザーパルスを発射し、標的細胞を胚の体から分離する。

栄養細胞の断片が胚盤胞から分離されたら、断片が生検ピペットに吸い戻されるのを防ぐために、胚盤胞から遠く離れた同じ生検ドロップに断片を放出する。保持ピペットから胚盤胞を放出し、速やかに両方のピペットを上げて、断片がピペットに付着するのを防ぎます。その後、品質管理の目的で生検断片を画像化します。

すべての胚盤胞が実証されているように生検されたら、生検皿を層流フードに戻し、生検後培養皿にカップルIDと各ドロップを胚およびサイクルIDでラベル付けします。証人の存在下で、きれいなIVF培地で胚盤胞をすすい、生検後皿の対応する落下に胚盤胞を移動させる。次に、生検後皿を摂氏37度、二酸化炭素6%、酸素インキュベーター5%に置きます。

目撃者の存在下で、室温で層流フードの内側に、永久的な、無毒なマーカーでPCRチューブをラベル付けします。生検胚IDで60 x 15ミリメートルのチューブ培養皿の蓋にラベルを付け、10マイクロリットルの生検洗浄液を皿に2滴加えます。140マイクロメートルのストリッピングピペットを、ステレオ顕微鏡の下のチューブ皿の2番目の滴から生検洗浄液でピペットを取り除き、栄養計の断片を可視化する。

栄養除去体の断片に生検洗浄液を緩やかに放出し、その断片をストリッピングピペットにロードする。断片を生検洗浄液の2番目の滴に移し、組織を2〜3回慎重に洗い流す。栄養除去片を、適切にラベル付けされたPCRチューブの底に、負荷液で移し、ストリッピングピペットの先端でチューブの壁に触れないように注意してください。

すべての断片がチューブに追加されたら、すべてのチューブをミニ遠心分離機で数秒間回転させ、断片を堆積させます。その後、サンプルをマイナス20度で保管し、検査のために参照遺伝子研究所に出荷します。栄養補助皮膚生検の30分以内に、患者の詳細とガラス化しなければならない胚盤胞のIDをガラス化プレートにラベル付けする。

特別な耐寒性のクライオラベルを使用して、ガラス化サポートに患者の名前と姓、カップルID、それにロードされる胚のID、および手順の日付をラベル付けします。室温では、ガラス化される各胚盤胞に300マイクロリットルの平衡溶液を分配し、証人の存在下で300マイクロメートルのストリッピングピペットを使用して、胚盤胞を1体積の平衡溶液に移動させます。ブラストシストを平衡溶液に13〜15分間放置します。

体積の初期収縮後、徐々に再膨張が観察されます。平衡の終わりに、ガラス化板の第2ウェルに300マイクロリットルのガラス化溶液を加え、完全に再拡張された胚盤胞をガラス化溶液に1分間移す。インキュベーションの終わりに、ブラストシストをリンスして平衡溶液を希釈し、証人の存在下で、ガラス化支持体に胚盤胞をロードする。

過剰なガラス化溶液を除去する。溶液の微妙なフィルムは、胚盤胞を囲む必要があります。ガラス化支持体を液体窒素に突っ込み、支持体を精力的に動かして、試料に近い泡形成のリスクを低減する。

その後、ガラス化支持体が液体窒素に沈んでいる間、支持体に保護キャップを置きます。この代表的な2年間に行われた1、544の栄養補助胚盤生検手順のうち、1〜4回の胚盤胞の間に、1回の処置につき3〜22分間生検した。これらのプロットでは、研究の三半期に沿った各オペレータの生検の平均タイミングが示され、全体の平均値は8.24分である。

品質管理のために各生検断片の画像を取得して、決定的な診断の原因が断片の寸法および/または品質、チューブ、または遺伝実験におけるサンプルの処理におけるいくつかの問題に対して生検された断片の画像を取得するのに役立ちます。本研究では、572個のユープロイド胚盤胞を温め、ユープロイディの診断後に胚移植を受けた。すべての胚盤胞は30分以内にガラス化し、胚盤胞の2.4%は31〜90分の間に再拡張せず、4.9%は再温暖化から90分を超えて再拡張しなかった。

特に質の悪い胚盤胞の場合、生検とガラス化の間のタイミングは、温暖化後の再膨張を達成するために重要なようです。栄養細胞と焼成との接合部を露出させる際には、透明帯を開く前に焦点を合わせ、ガラス化前に胚盤胞の再拡張を防ぐようも注意してください。他の2つの胚盤胞生検アプローチが存在し、透明帯の開口部を伴い、栄養細胞の自発的なアーチを待っている。

これらのアプローチは簡単ですが、より多くの操作が必要であり、より時間がかかります。このワークフローの有効性は、胚移植前に移植する可能性が最も高い胚盤胞を選択しようとするIVFにおける分子技術の実施を可能にする。胚に有毒である可能性のあるデバイスや溶液を使用せず、DNAフリー物質を使用してDNA汚染を防ぐことを忘れないでください。

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