Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Digitalt PCR-baseret konkurrencemæssigt indeks til analyse af egnethed til salmonella med høj gennemløb
Chapters
Summary May 13th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne molekylære tilgang til bestemmelse af bakterie egnethed letter præcis og præcis påvisning af mikroorganismer ved hjælp af unikke genomiske DNA-stregkoder, der kvantificeres via Digital PCR. Protokollen beskriver beregningen af konkurrence indekset for salmonella stammer teknologien er dog let at tilpasse til protokoller, der kræver absolut kvantificering af enhver genetisk-formbare organisme.
Transcript
Denne teknik muliggør nøjagtig og præcis kvantificering af mikroorganismer fra en blandet population af meget lignende stammer ved hjælp af hurtige og høj gennemløbsrelekylær-baserede teknikker. I sidste ende, i at gøre det muligt sammenligninger af fitness, der skal foretages mellem stammer. Evnen til samtidig at vurdere mange stammer i en enkelt pulje reducerer i væsentlig grad godt-til-godt eller organisme-til-organisme variabilitet, fordi alle stammer er udsat for nøjagtig de samme betingelser.
Tilpasningsevnen af denne teknik gør det muligt at bruge den til næsten enhver genetisk formbar organisme og næsten ethvert eksperimentelt design, der kræver nøjagtig kvantificering af mikrober. Begynd denne procedure med engineering af genetiske markører på bakterielle kromosomer, som beskrevet i tekstprotokollen. Opret en pulje af genomisk DNA, der indeholder alle stregkoder undtagen én.
Brug denne pulje som fortyndingst for at udføre en fortyndingsserie med genomisk DNA, der indeholder den enkelte resterende stregkode. Forbered reaktioner på digital PCR i to eksemplarer i henhold til producentens anbefalinger til brug af en digital PCR supermix designet til sonde-baseret kemi. Brug det samlede genomiske DNA som skabelon-DNA.
Tilføj også 20 X primer-sonden Master Mix som beskrevet i tekstprotokollen. Forbered replikerede kontrolreaktioner til digital PCR i henhold til producentens anbefalinger. Kontrolreaktioner for hver sondeblanding må bestå af Ingen skabelonkontrol, negative kontroller og positive kontrolelementer.
Gentag disse trin for at oprette digitale PCR-reaktioner for hver stregkodet genomisk DNA-prøve. Generer dråber for hver reaktionstilstand ved hjælp af en dråbegenerator i henhold til producentens anvisninger. Overfør nyoprettede dråber i den relevante 96 brøndplade.
Brug 200 mikrolit pipettespidser på en 5 til 50 mikroliter multi-kanaliseret pipette. Når alle dråberne er genereret og overført, forsegles pladen med en foliepladeforsegling. Brug producentens anbefalede termiske cykler til at udføre cykelforholdene.
Mens der udføres termocykling, programmeres dataanalysesoftwaren med oplysninger om pladeopsætning, f.eks. Medtag også Target 1-navn og mål 1-type samt Target 2-navn og Mål 2-type. Når termocyklingen er færdig, overføres de færdige reaktioner til dråbelæseren, og læseprocessen startes i henhold til producentens anvisninger.
Når alle brønde er blevet læst, og kørslen er fuldført, skal du åbne QLP-datafilen ved hjælp af dataanalysesoftwaren. Vælg alle brønde, der udnytter den samme primer sonde Mastermix. Under fanen Dråber skal du undersøge antallet af dråber, der analyseres i hver brønd, herunder både positive og negative dråber.
Udeluk fra analyse enhver brønd, der er mindre end 10.000 samlede dråber. Flyt til fanen 1D Amplitude, og undersøg amplituderne af positive og negative dråber. Sørg for, at de omfatter 2 forskellige populationer.
I softwaren skal du bruge tærskelfunktionen til at foretage en afskæring mellem positive og negative dråber for hver sonde, der blev udnyttet. Når passende tærskler er blevet anvendt på alle brønde, vil softwaren beregne antallet af DNA-kopier i hver reaktion. Eksporter data til et regneark for at lette yderligere analyse.
Ved hjælp af disse værdier skal du beregne det første kopinummer for hver entydig genomisk stregkode i prøven. Den gennemsnitlige falske positive rate bestemmes af de negative kontrolreaktioner, og denne værdi trækkes fra de værdier, der opnås ved forsøgsreaktioner. Multiplicer værdierne efter behov baseret på de fortyndinger, der blev udført ved opsætning af hvert eksperiment.
Nu, bestemme den relative egnethed af en organisme ved at beregne den konkurrencedygtige indeks eller annulleret konkurrencedygtige indeks fra digital PCR-baseret kvantificering af den stregkodede stamme. Udfør dette trin for hver stregkodet stamme på alle tidspunkter. Genomisk DNA, der indeholder AA stregkoden blev fortyndet i en baggrund af alle andre stregkodede genomiske DNA.
Kanal 1 repræsenterer FAM-sonden for AA-stregkoden, mens Kanal 2 repræsenterer HEX-sonden for AO-stregkoden. Resultaterne af hver sonde præsenteres som både individuelle dråbelysstofrør og et histogram, der repræsenterer hyppigheden af lysstofrørintensiteten af alle dråber i de valgte brønde. For hver tilstand skal positive og negative dråber danne 2 forskellige populationer.
Populationerne bør adskilles ved hjælp af tærskelfunktionen for at definere positive og negative dråber. Tærskelværdier vil variere afhængigt af de sonder, der blev brugt, men alle brønde, der udnytter den samme sondeblanding, bør have identiske tærskler. For AA, der blev fortyndet, synes histogrammet kun at vise den enkelte population, fordi positive dråber er væsentligt i undertal af negative dråber.
Men, 2 forskellige populationer er stadig synlige ved at undersøge dråbe fluorescerende amplitude i venstre paneler. Da AA-stregkodet genomisk DNA blev fortyndet, var der et fald i antallet af positive AO-dråber forbliver konstant. Når passende tærskler er blevet anvendt på alle brønde softwaren vil beregne antallet af DNA-kopier i hver reaktion.
Hvis du rutinemæssigt udfører PCR som en del af din forskning, kan du udføre denne teknik til at vurdere egnetheden af din model organisme. Denne procedure vil normalt blive anvendt til at bestemme slutresultaterne af forudgående eksperimenter. Dens sande nytte er at fremme lethed og alsidighed for alle eksperimenter, der er afhængige af bakteriel kvantificering.
Vi bruger denne teknik til at vurdere salmonella fitness i en murine model af infektion. Derudover er denne teknik ved at blive tilpasset til brug sammen med andre patogene mikroorganismer i vores laboratorium.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
