Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Isolering og kvantificering af Zikavirus fra flere organer i en mus

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Journal (Immunology and Infection)

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Journal (Immunology and Infection)

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Click here for the English version

Isolering og kvantificering af Zikavirus fra flere organer i en mus

Article DOI: 10.3791/59632-v

August 15th, 2019 •

James D. Brien*¹, Mariah Hassert*¹, E. Taylor Stone¹, Elizabeth Geerling¹, Lillian Cruz-Orengo², Amelia K. Pinto¹

¹Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, ²School of Veterinary Medicine University of California Davis

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

August 15th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Målet med protokollen er at demonstrere de teknikker, der anvendes til at undersøge virussygdom ved at isolere og kvantificere Zikavirus, fra flere organer i en mus efter infektion.

Transcript

I denne video beskriver vi et sæt procedurer designet til at afhøre virkningen af en virusinfektion og den deraf følgende immunologiske respons ved hjælp af en Murine model af Zika infektion. Denne protokol er vigtig, fordi den giver os mulighed for at udvikle en mekanistisk forståelse af infektion og immunitet ved at identificere, i hvilket omfang en virus har spredt sig over hele kroppen, tværgående fysiske barrierer og adgang til væv. Disse teknikker giver mulighed for en detaljeret forståelse af viral patogenese og giver mulighed for at dissekere mekanismen for beskyttelse, som vacciner eller terapi.

Her demonstrerer vi denne metode ved hjælp af Zika virus infektion af mus, men denne metode kan anvendes på en række virusinfektioner, herunder andre flaviviruses som Dengue virus og alfavira som Chikungunya virus. Høst organer i centralnervesystemet kan være udfordrende, så det er vigtigt for en person at planlægge et lille eksperiment, og være parat til at praktisere de teknikker på forhånd. Denne protokol giver mulighed for hurtig dissektion af viral spredning i små dyremodeller med evnen til at visualisere, fange og lagre eksperimentelle data.

Det er vigtigt visuelt at demonstrere denne metode for at give eksperimentatoren mulighed for at forstå, hvordan man høster centralnervesystemets organer. Det er også vigtigt at se niveauet af celle sammenløb og intensiteten af den virale foci. Til at begynde, skal du bruge krafterne til at fjerne pelsen af den inficerede mus.

Halshugge hovedet af musen med en saks, efterfulgt af fjernelse af arme og ben. At høste hjernen, bruge savtakkede La Grange saks til at skære kraniet gennem foramen magnum. Skræl kraniet med kraftvuk, og scoop ud hjernen med en spatel.

Ved hjælp af stærk afstumpet saks, fjerne knoglen omkring rygsøjlen, derefter skæres over bækkenbenet at udsætte vertebrale foramen på lændeniveau. Derefter fjerne så meget muskel som muligt omkring rygsøjlen. Forsigtigt, placere den affasede spids af nålen inde i vertebrale foramen, undgå overdrevent tryk for at forhindre nålen indtrængen rygsøjlen kroppen.

Hold kraftigt nede for at lægge pres på rygsøjlen og nålen, og tryk sprøjtestempelet for at udvise ledningen i petriskålen. Straks overføre rygmarven i det mærkede rør, og sted i tørisbad for yderligere homogenisering. Til homogenisering tilsættes en milliliter DMEM, og prøven homogeniseres i en BeadBeater.

Efter at have sikret organer er homogeniseret, centrifuge og aliquot prøver på is og opbevares i minus 80 grader Celsius indtil det er nødvendigt. På analysedagen fjernes de homogeniserede prøver fra minus 80 grader Celsius-fryseren, og de kan tø op. Med prøverne på is fortyndes Zika-virus tigange i fortyndingspladens første brønd, og brug en flerkanalpipette til at udføre tifolde serielle fortyndinger ned ad pladen og skifte spidser hver gang.

Ved at tilføje 20 mikroliter af prøven i 180 mikroliter af vækstmedier, skal du ændre pipettespidserne mellem hver fortynding. Forbered fokusdannende plade ved at fjerne medierne fra den forberedte flade bund 96-brønd plade, der dækker virocells. For at forhindre monolaget i at tørre ud, straks tilføje 100 mikroliter af virus fortynding til hver brønd i viroplate.

Brug det samme sæt tips til at tilføje fra den laveste til den højeste koncentration. Rock plade side til side to til fire gange og inkubere ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i en til to timer. Varm op 2% methylcellulose til stuetemperatur.

Derefter fortyndes 2%methylcellulose opløsning i vækstmedier med et forhold på ca. to til en. Efter inkubation, tilsæt 125 mikroliter af methylcellulose vækstmedier til hver brønd af de 96-brønd plader. Inkubere igen ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i 32 til 40 timer.

For at fastsætte virocells, i en biosikkerhed kabinet tilføje 50 mikroliter af 5% paraformaldehyd over toppen af methylcellulose lag i hver brønd af 96-brønd plader. Inkuber i 60 minutter ved stuetemperatur. Alternativt kan du dække pladerne med Parafilm og placere dem på fire grader Celsius natten over.

Derefter skal du bruge en pipette til at fjerne overlejring og medier fra celler i en engangsbeholder inde i biosikkerhedsskabet. Vask forsigtigt med 150 mikroliter PBS pr. brønd. Fjern PBS fra pladerne, og fjern pladen fra biosikkerhedsskabet.

Gentag PBS vask to gange, derefter tilføje 150 mikroliter pr godt en gange FFA vask buffer og lad ved stuetemperatur i fem til 10 minutter at permeabilize de faste celler. Dernæst skal du bruge primært Zika antistof til at opdage infektion. Forbered det primære antistof 4G2 ved en koncentration på et mikrogram pr. milliliter i FFA-farvningsbufferen.

Flick FFA vask buffer fra pladerne, og tilsæt 50 mikroliter af det primære antistof i FFA farvning buffer til hver brønd. Derefter forsegle pladerne med Parafilm, eller plastfilm, og inkubere natten over ved fire grader Celsius. Forbered den sekundære gå anti-mus HRP mærket antistof ved en koncentration på en til 5, 000 i FFA farvning buffer.

Efter fjernelse af antistofopløsningen vaskes cellerne tre gange med 150 mikroliter FFA vaskebuffer pr. brønd. Fjern vaskebufferen ved at svippe ind i vasken hver gang. Plet cellerne med det sekundære antistof i FFA farvning buffer på 50 mikroliter pr brønd og inkubere en til to timer ved stuetemperatur.

Efter at vaske celler tre gange med FFA vask buffer, igen, fjerne vask buffer ved at svippe ind i vasken hver gang. Tilføj 50 mikroliter af TrueBlue-substratet i hver brønd. Vent to til 15 minutter, indtil pletterne er fuldt defineret med minimal baggrund.

Når pletterne er synlige, vaskes forsigtigt med vand ved hjælp af en hånd for at beskytte monolaget mod kraften i vandet, der løber. Tryk tør på papirservietter. Kort tid efter skal du bruge et dissekereområde til manuelt at tælle pletterne i hver brønd eller bruge en automatiseret spottæller.

I ImmunoCapture software, skal du vælge en fortynding med let skelnes foci mellem 20 til 200 per brønd for hver prøve og beregne titer i fokusdannende enheder per millimeter ved hjælp af gennemsnittet af dublerede brønde. I dette eksperiment blev virusbyrden vist i det perifere væv og væv i centralnervesystemet, efter at Ifnar-mus fik zikavirus subkutaneligt. Grænsen for påvisning var mellem 100 til 500 FFU pr. gram, baseret på orgel.

Når du udfører fokusdannende analyse, kan tekniske fejl resultere i suboptimale resultater. Organtoksicitet, drevet af høj koncentration af leveren, ændrede følsomheden af analysen. Når den virale titer i orglet var lavere end toksiciteten, kunne FFA ikke præcist registrere de virale titere.

Nyreceller illustreret toksicitet med høj organkoncentration, men blev overvundet af den virale titer ved lave organkoncentrationer. Kraftig pipettering eller vask kan fjerne monolaget, hvilket fører til mistede data unøjagtig rapportering af titer resultater. Fibre eller hår, der er til stede i lab bænk absorberende papir, kan forurene individuelle brønde og forårsage betydelige fejl, hvis du bruger en automatiseret optælling program.

Celletæthed er et andet spørgsmål, som dramatisk kan påvirke succesen af en fokusdannende analyse. Celler ved ca 60% sammenløb i starten af analysen, sammenlignet med celler belagt med 90% sammenløb, viste dramatisk forskel påvirker fokusdannende analyse. Planlægning af eksperimentets størrelse og omfang, således at organhøsten gennemføres effektivt, er den vigtigste del af proceduren, efterfulgt af at starte den fokusdannende analyse med celler af høj kvalitet.

Denne procedure er blevet brugt til at kvantificere virus for flere virale familier. Denne protokol kan også tilpasses til skærmen for terapeutiske forbindelser og kvantificere neutraliserende antistof titere. Disse teknikker anvendes til at kvantere levende virus, og der bør træffes passende sikkerhedsforanstaltninger i overensstemmelse med retningslinjerne i BMBL.

X

Simple Hit Counter