Biochemistry
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Ein semi-quantitativer Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Assay zur Untersuchung der Rapamycin/mTOR-Interaktion
Chapters
Summary August 27th, 2019
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In dieser Studie haben wir die Datenanalysefunktionen des DARTS-Experiments verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwacht enden und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzen. Die Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin-Interaktion als beispielhaften Fall genutzt.
Transcript
Die ansprechende Zielstabilität der Arzneimittelaffinität, DARTS, ist eine robuste Methode zum Nachweis neuartiger kleinmolekularer Proteinziele. Es kann verwendet werden, um bekannte kleine Molekül-Protein-Wechselwirkungen zu überprüfen und potenzielle Proteinziele für natürliche Produkte zu finden. In dieser Studie verbessern wir die Datenanalysefähigkeiten des DARTS-Experiments weiter, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwachen und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzen.
Die Protein-Ligand-Wechselwirkungen können gegen zwei Kurven, eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve dargestellt werden. Wir haben die mTOR-rapamycin Interaktion als beispielhaftes Argument für die Erstellung unseres Protokolls verwendet. Wachsen Sie 293T-Zellen mit DMEM mit 10% fetalem Rinderserum, Zwei-Millimolar-Glutamin und 1%Antibiotika.
Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Wenn die Kultur 80 bis 90% Zusammenfluss erreicht, waschen Sie die Zellen zweimal mit kalten PBS. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen in eine entsprechende Menge kaltzelllysepuffer zu sammeln und die Lysing-Zellen in ein 1,5-Millimeter-Rohr zu übertragen.
Invertieren, um den Lysepuffer und die Lysing-Zellen gut zu mischen und die Röhre 10 Minuten lang auf Eis zu inkubieren. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 18.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Den Überstand in eine neue 1,5-Milliliter-Röhre geben und auf Eis gekühlt halten.
Führen Sie einen BCA-Test durch, um die Proteinkonzentration von Lysaten anzunähern und die Verdünnung der Pronase auf der Grundlage der Proteinkonzentration zu berechnen. Übertragen Sie das Lysat zunächst in zwei 1,5-Milliliter-Röhren mit jeweils 99 Mikrolitern. Fügen Sie jedem Aliquot von Lysat einen Mikroliter Kleinmolekül-Stammlösung hinzu und inkubieren Sie die beiden Röhren 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur mit Schütteln.
Auf Eis, stellen Sie serielle Verdünnungen der frisch aufgetauten Pronase-Lösung in 1x TNC. Nach der Inkubation mit dem kleinen Molekül, teilen Sie jedes Aliquot in 20 Mikroliter Proben in fünf Röhren. Um die gleiche Verdauungszeit zu gewährleisten, in bestimmten Intervallen von alle 30 Sekunden, fügen Sie zwei Mikroliter der vorbereiteten Pronase-Lösungen zu den Proben entsprechend hinzu.
Fügen Sie für die eine Steuerungsgruppe zwei Mikroliter TNC-Puffer hinzu. Nach fünf bis 20 Minuten die Verdauung der sechs Röhren durch Zugabe von zwei Mikrolitern kalten 20x Protease-Hemmer-Cocktails in 30-Sekunden-Intervallen stoppen. Gut mischen und 10 Minuten auf Eis bebrüten.
Jede Probe mit sechs Mikrolitern 5x SDS-PAGE Ladepuffer verdünnen und die Proben in einem Wasserbad bei 70 Grad Celsius 10 Minuten kochen. Um nun Western Blot auszuführen, laden Sie gleiche Mengen an Protein in die Brunnen eines 8%SDS-PAGE-Gels, zusammen mit einem geeigneten Molekulargewichtsmarker. Führen Sie das Gel 30 Minuten bei 80 Volt aus, stellen Sie dann die Spannung auf 120 Volt ein und fahren Sie ein bis zwei Stunden weiter.
Stellen Sie sicher, dass das kleine Molekül direkt an die potenziellen Zielproteine binden kann. In diesem Protokoll bestätigte die Inkubation mit dem kleinen Molekül den Schutz gegen Proteolyse. Es wurde festgestellt, dass drei Bands durch Inkubation mit Rapamycin über die Fahrzeugkontrolle geschützt wurden.
Western Blotting veranschaulichte das Vorhandensein von mTOR-Protein bei niedrigen Pronase-Protein-Verhältnissen und seine Reduktion und Verlust mit steigenden Verhältnissen. Die Proteolyse von mTOR durch Pronase wurde durch das Vorhandensein von Ramamycin deutlich gehemmt und die Zugabe von Ramamycin erzeugte eine offensichtliche Verschiebung der proteolytischen Kurve. Rapamycin dosisabhängig verbesserte das Niveau von mTOR, was auf die steigende Stabilität von mTOR mit Rapamycin-Behandlung hindeutet.
Die Quantifizierung der Zielproteinbandintensitäten deutete darauf hin, dass mTOR das Zielprotein von Ramamycin ist. Um den besten stufenweisen Effekt zu erzielen, muss dieses Experiment möglicherweise mehrmals wiederholt werden, um einen geeigneten Bereich von Pronase über Proteinverhältnissen zu erhalten.
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