Renal subkapsulær transplantation af 2 '-Deoxyguanosin-behandlede murine embryonale thymus i Nude mus

Thymus transplantation er en vigtig metode til undersøgelse af thymus epitelcellefunktion og T-celle modning in vivo. Denne enkle og effektive protokol kan bruges til at isolere og kultur mus 18,5 thymus til efterfølgende transplantation i en nyrekapsel. Protokollen for 18,5 thymus transplantation kan ændres til thymic transplantation på andre udviklingsstadier eller for andre væv af samme størrelse.

Også, denne procedure er meget enkel. Detaljerne for nogle af sagsfrimærkerne bør gennemgås omhyggeligt, når denne teknik udføres for første gang. Denne procedure indeholder detaljerede manipulationer, der bedre kan illustreres med visualisering.

Efter ofring, tør embryonale dag 18,5 gravid mus med 70% ethanol og bruge autoklavede steriliserede instrumenter til at gøre en v-formet snit på maven fra blæren op til hvert horn i livmoderen. Brug saks til at skære mesometrium og livmoderhalskræft og vaginal områder og høste livmoderen i en petriskål, der indeholder koldt PBS på is. Skær den forreste livmodervæg fra den ene livmoder horn til den anden for at udsætte embryoner i omslutt for at decidua og bruge fine pincet til at skrælle tilbage den afgørende væv.

Skær navlestrengen for at frigive embryonerne til overførsel til en ny petriskål på is. At høste den første thymus, tør et foster med 70% alkohol og overføre fosteret i en ny petriskål. Efter halshugning, fastgør fosteret i skålen i liggende position og brug steril saks til at skære den laterale brystvæg vandret langs aksillær front.

Skær mellemgulvet for at åbne brystet. Thymus skal være synlig som to hvide lapper placeret foran luftrøret og støder op til hjertet. Indsæt forsigtigt bøjede spidsfræt bag thymusen og træk forsigtigt op for at høste vævet.

Kontroller integriteten af thymus at bekræfte, at det indeholder to fled lapper. Vask derefter thymus med PBS, før du bruger et stereomikroskop til at trimme bindevævet og blodkarrene væk. Når alle thymi er blevet indsamlet, overføre hver ren væv i individuelle brønde af en 24 godt plade, der indeholder 500 mikroliter af kultur medium pr brønd.

Og tilsæt 2’deoxygranosin til en endelig koncentration på 1,25 millimolar per brønd. Derefter placere den isolerede thymi i cellen kultur kuvøse i otte dage. På den sidste kulturdag skal du bruge en saks til at skære en hovedbundsål på infusionsrørets del i en 45 graders vinkel og bekræfte manglende reaktion på tåspidsiske i et nøgenmodtagerdyr.

Placer musen på operationsbordet i en ret lateral position og bruge en 0,5% povidone jod podning at po pode huden i det kirurgiske område to gange indefra til ydersiden af kroppen. Brug skalpel til at gøre en fem til ni millimeter hud snit parallelt med rygsøjlen i venstre nyreområde og skære gennem det subkutane væv og muskler til at åbne bughulen. Ved hjælp af et par pincet med den ene hånd, løfte muskler og fedtvæv fra rygsøjlen indsnit kant af den eksponerede nyre og bruge den anden hånd til forsigtigt at presse ud af nyrerne.

For at holde nyrekapslen fugtig under operationen, våd overfladen af nyrerne med saltvand og bruge hovedbunden nålen til forsigtigt at ridse nyrekapslen på nederste højre side omkring 1/2 til 2/3 bredden af nyrerne. Skub infusionsrøret ind i kapslens nick og løsrive forsigtigt nyrekapslen fra nyrerne, længe den lange side af nyrerne er ca. tre til fire millimeter i nyrekapslen. Træk derefter infusionsrøret tilbage.

For at implantere thymus i det skabte subcapsular rum, vaske en kultur thymus to gange i frisk saltvand og forbinde klippet infusionsrør til en sprøjte. Langsomt aspirere den forberedte thymus ind i det modificerede infusionsrør. Og sæt forsigtigt infusionsrøret ind i nyrekapslen, indtil den når den overlegne pol.

For at aflevere thymusen ind i nyrekapslen skal røret trækkes langsomt tilbage, samtidig med at stemplet trykkes forsigtigt ned. Ved hjælp af en alkohollampe, lidt varme hovedbunden nålen og efter at have bekræftet, at hele thymus er inde i subcapsular plads, skal du bruge den opvarmede nål til at ætse nick. Gendan cauterized nyre til bughulen og lukke bughinden og muskel med suturer.

Ved hjælp af en modificeret afbrudt lodret madras sutur, lukke huden snit med mindst tre knob og bruge en povidone jod podning at desinficere snittet. Derefter give en subkutan injektion af antibiotika og analgesi og placere musen under en infrarød lampe med overvågning, indtil fuld helbredelse. Her kan en isolere embryonal dag 18,5 thymus indeholdende to komplette lapper observeres.

Umiddelbart efter implantationen kan thymusen visualiseres under nyrekapslen på spidsen af recipientnyren. Efter otte ugers vækst inden for den nøgne mus modtager dyr, thymus forbliver under kapslen, men stiger robust i størrelse. T-celler produceres i både den transplanterede thymus og det perifere blod af nøgne musemodtagere.

Men som forventet, ingen T-celler påvises i den perifere af ikke-transplanterede nøgne dyr. I dette repræsentative eksperiment blev der desuden ikke påvist noget LacZ-gen i de perifere T-celler, der blev høstet fra det perifere blod fra nøgne musemodtagere transplanteret med thymuslapper indeholdende LacZ-allelen, hvilket indikerer, at perifere T-celler blev genereret fra recipientdyrene. Vær forsigtig, når du skubber røret ind i en nyrekapsel.

Undgå at bryde kapslen. Og sørg for at have nok plads i til thymus levering. Thymiske eller perifere T-celle populationer kan analyseres ved hjælp af flow cytometer.

Hvor, immunrespons i modtagerens perifere væv kan analyseres af I2D og immun histokemiske analyse.