Trasplante subcapsular renal de timo embrionario murino tratado con 2'-desoxiguanosina en ratones desnudos

El trasplante de timo es un método importante para investigar la función de la célula epitelial del timo y la maduración de las células T in vivo. Este protocolo simple y eficiente se puede utilizar para aislar y cultivar el ratón 18,5 timo para su posterior trasplante en una cápsula renal. El protocolo para el trasplante de timo 18,5 se puede modificar para el trasplante timático en otras etapas del desarrollo o para otros tejidos de un tamaño similar.

Además, este procedimiento es muy simple. Los detalles de algunos de los sellos de caso deben revisarse cuidadosamente al realizar esta técnica por primera vez. Este procedimiento contiene manipulaciones detalladas que se pueden ilustrar mejor con la visualización.

Después del sacrificio, limpie el ratón embarazada del día embrionario 18.5 con 70%etanol y use instrumentos esterilizados autoclaves para hacer un corte en forma de V en el abdomen desde la vejiga hasta cada cuerno del útero. Use tijeras para cortar el mesometrio y las áreas cervicales y vaginales y cosechar el útero en un plato de Petri que contenga PBS frío sobre hielo. Cortar la pared uterina anterior de un cuerno uterino a la otra para exponer los embriones dentro del envoltorio a decidua y utilizar pinzas finas para pelar de nuevo los tejidos deciduales.

Corte el cordón umbilical para liberar los embriones para transferirlos a una nueva placa De Petri sobre hielo. Para cosechar el primer timo, limpie un embrión con 70% de alcohol y transfiera el embrión a un nuevo plato de Petri. Después de la decapitación, fijar el embrión en el plato en la posición supina y utilizar tijeras estériles para cortar la pared lateral del pecho horizontalmente a lo largo del frente axilar.

Corta el diafragma para abrir el pecho. El timo debe ser visible como dos lóbulos blancos situados delante de la tráquea y adyacentes al corazón. Inserte cuidadosamente los fórceps de la punta dobladas detrás del timo y tire suavemente hacia arriba para cosechar el tejido.

Compruebe la integridad del timo para confirmar que contiene dos lóbulos articulados. Luego lava el timo con PBS antes de usar un microscopio estéreo para recortar los tejidos conectivos y los vasos sanguíneos. Cuando se hayan recogido todos los timos, transfiera cada tejido limpio a pozos individuales de una placa de 24 pozos que contenga 500 microlitros de medio de cultivo por pozo.

Y añadir 2’desoxigranosina a una concentración final de 1.25 milimolar por pozo. A continuación, coloque el timi aislado en la incubadora de cultivo celular durante ocho días. En el último día de cultivo, utilice tijeras para cortar una aguja de vena del cuero cabelludo en la parte del tubo de perfusión en un ángulo de 45 grados y confirme una falta de respuesta a la pellizca del dedo del dedo en un animal receptor desnudo.

Coloque el ratón sobre la mesa de operaciones en una posición lateral derecha y utilice un hisopo de yodo 0.5%povidona para frotar la piel en el área quirúrgica dos veces desde el interior hasta el exterior del cuerpo. Utilice el bisturí para hacer una incisión cutánea de cinco a nueve milímetros paralela a la columna vertebral en el área renal izquierda y corte a través del tejido subcutáneo y el músculo para abrir la cavidad abdominal. Usando un par de pinzas con una mano, levante el músculo y el tejido graso del borde de la incisión del lado de la columna vertebral del riñón expuesto y use la otra mano para exprimir suavemente el riñón.

Para mantener la cápsula renal húmeda durante la cirugía, humedezca la superficie del riñón con solución salina y utilice la aguja del cuero cabelludo para rayar suavemente la cápsula renal en la parte inferior derecha alrededor de 1/2 a 2/3 de la anchura del riñón. Deslice el tubo de perfusión en el nick de la cápsula y desensare suavemente la cápsula renal del riñón durante el lado largo del riñón de unos tres a cuatro milímetros en la cápsula renal. A continuación, retraiga el tubo de perfusión.

Para implantar el timo en el espacio subcapsular creado, lave un cultivo timo dos veces en solución salina fresca y conecte el tubo de infusión recortado a una jeringa. Aspirar lentamente el timo preparado en el tubo de perfusión modificado. E inserte suavemente el tubo de perfusión en la cápsula renal hasta que llegue al polo superior.

Para introducir el timo en la cápsula renal, retraiga el tubo lentamente mientras presiona suavemente suavemente el émbolo. Usando una lámpara de alcohol, calienta ligeramente la aguja del cuero cabelludo y después de confirmar que todo el timo está dentro del espacio subcapsular, usa la aguja calentada para cauterizar la muesca. Restaure el riñón cauterizado a la cavidad abdominal y cierre el peritoneo y el músculo con suturas.

Usando una sutura de colchón vertical interrumpida modificada, cierre la incisión de la piel con al menos tres nudos y use un hisopo de yodo povidona para desinfectar la incisión. A continuación, proporcione una inyección subcutánea de antibióticos y analgesia y coloque el ratón debajo de una lámpara infrarroja con monitoreo hasta la recuperación completa. Aquí, se puede observar un día embrionario aislado 18,5 timo que contiene dos lóbulos completos.

Inmediatamente después de la implantación, el timo se puede visualizar debajo de la cápsula renal en la punta del riñón receptor. Después de ocho semanas de crecimiento dentro del animal receptor de ratón desnudo, el timo permanece debajo de la cápsula, pero aumenta fuertemente en tamaño. Las células T se producen tanto en el timo trasplantado como en la sangre periférica de los receptores de ratón desnudos.

Pero como era de esperar, no se detectan células T en el periférico de animales desnudos no trasplantados. Además, en este experimento representativo, no se detectó ningún gen LacZ en las células T periféricas extraídas de la sangre periférica de receptores de ratones desnudos trasplantados con lóbulos de timo que contienen el alelo lacZ, lo que indica que se generaron células T periféricas a partir de los animales receptores. Sea suave al deslizar el tubo en una cápsula renal.

Evite romper la cápsula. Y asegúrate de tener suficiente espacio para la entrega del timo. Las poblaciones timicas o periféricas de células T se pueden analizar utilizando un citometro de flujo.

Donde, las respuestas inmunitarias en los tejidos periféricos del receptor pueden ser analizadas por I2d y el análisis histoquímico inmune.