Login processing...

JoVE Journal
Genetics

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Genetics

In vivo funktionel undersøgelse af sygdoms associerede sjældne humane varianter ved hjælp af Drosophila

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Journal (Genetics)

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Journal (Genetics)

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Click here for the English version

In vivo funktionel undersøgelse af sygdoms associerede sjældne humane varianter ved hjælp af Drosophila

Article DOI: 10.3791/59658-v

August 20th, 2019 •

J. Michael Harnish*¹, Samantha L. Deal*², Hsiao-Tuan Chao^1,3,4,5, Michael F. Wangler^1,2,4, Shinya Yamamoto^1,2,4,5

¹Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, ²Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, ³Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, ⁴Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, ⁵Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

August 20th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Formålet med denne protokol er at skitsere design og udførelse af in vivo eksperimenter i Drosophila melanogaster for at vurdere de funktionelle konsekvenser af sjældne genvarianter forbundet med sygdomme hos mennesker.

Transcript

Denne protokol giver os mulighed for at afgøre, om missense varianter i menneskelige gener, der er knyttet til sygdomme påvirker protein funktion. Dette er vanskeligt at opnå beregningsmæssigt selv med state-of-the-art algoritmer. Denne teknik giver mulighed for en hurtig analyse af missense varianter i humane proteiner ved hjælp af en in vivo system Drosophila melanogaster som er hurtigere og mere omkostningseffektiv end hvirveldyr model organismer.

Viser, at en bestemt variant påvirker proteinfunktionen direkte bidrager til diagnosticering af sjældne sygdomme og tjener som udgangspunkt for sygdomsmekanismeanalyser og potentielle behandlinger. Denne protokol er især nyttig, når man studerer varianter knyttet til sjældne sygdomme, men det kan anvendes på mere almindelige sygdomme som autisme og kræft. Det kan være en udfordring at identificere reproducerbare fænotyper i fluer, der afspejler proteinfunktionen.

Fænotyperne kan variere fra gen til gen og kan være subtile. Funktionelle undersøgelser af varianter i humane proteiner ved hjælp af Drosophila kan udføres baseret på redningsforsøg eller overekspressionsundersøgelser. Før du begynder proceduren, indsamle oplysninger om det menneskelige gen af interesse og dens model organisme orthologs.

For at teste variantfunktionen ved at overekspressere reference- og variantproteiner i det visuelle fluesystem, generere transgene fluer, der udtrykker reference eller variant af menneskelige cDN'er af interesse under kontrol af Gal4 opstrømsaktiveringssekvensen eller UAS-systemet. Hvis du vil vælge en specifik Gal4 linje til at udtrykke de menneskelige proteiner i en bestemt fluevæv, krydse tre til fem jomfru hunner fra Gal4 linje med tre til fem hanner fra hver af de UAS menneskelige cDNA transgene linjer i enkelt hætteglas eller i dubletter. Krydsningerne overføres hver anden til tredje dag for at få så mange dyr, der afskærmes fra et enkelt kryds som muligt, og det e-lukkede dyr undersøges under dissektionsmikroskop for at identificere eventuelle forskelle mellem reference- og variantstammerne.

Hvis der er en synlig defekt, skal du afbilde fluerne for at dokumentere fænotyperne. At generere fluer til test for funktionelle defekter i det visuelle system, kryds jomfru hunner fra rhodopsin 1 Gal4 linje til mænd med reference eller variant UAS human cDNA transgenes at udtrykke de menneskelige proteiner af interesse i fotoreceptors R1 til R6 i flue nethinden. Når fluerne begynder at eclose, samle afkomgene i friske hætteglas og returnere hætteglassene til en inkubator indstillet til den relevante eksperimentelle temperatur i yderligere tre dage, så det visuelle system til at modnes.

Ved slutningen af inkubationen, immobilisere fluerne med en passende anæstesi metode og forsigtigt lim den ene side af hver flue på et glas mikroskop dias. Efter opsætning af en elektroretinogram rig, placere en 1,2 millimeter glas kapillær i en nål puller og bryde kapillær røret for at opnå to skarpe hule koniske elektroder med mindre end 0,5 millimeter diametre. Fyld kapillærerne med 100 millimolar saltvandsopløsning, der skal sikre luftbobler og skub glaskapillærerne over sølvtrådselekterne.

Fastspænd kapillærerne på plads og akklimatisere fluerne til komplet mørke i mindst 10 minutter ved stuetemperatur. Ved slutningen af tilvænningen anbringes det dias, der indeholder fluerne, på optageapparatet, og mikromanipulatorerne, der bærer reference- og optagelseselektroderne, flyttes tæt på den flue af interesse. Se spidsen af elektroden, forsigtigt placere reference elektroden i brystkassen af fluen trænger neglebånd og placere optagelsen elektroden på overfladen af øjet.

For vellykkede elektroretinogram optagelser, passe på at anvende en passende mængde af tryk på optagelsen elektroden, så det forårsager en lille smilehul uden at trænge ind i øjet. Når elektroderne er placeret, skal du slukke for det primære lys i tre minutter for at re-akklimatisere fluerne til det mørke miljø. Ved afslutningen af re-akklimatiseringsperioden skal du åbne og lukke lukkeren en gang i sekundet i 20 sekunder, hvor elektroretinogrammet registreres fra mindst 15 fluer pr. dias pr. genotype pr. tilstand ved hjælp af de samme elektroder.

Når optagelserne fra reference- og variantfluerne er færdige, skal elektroretinogramoptagelserne sammenlignes med reference, variant og kontrol for at vurdere forskellene. Derefter evaluere elektroretinogram data for ændringer i på transienter, depolarisering, off forbigående og repolarization. I dette repræsentative eksperiment blev der udført overekspressionsbaserede undersøgelser for TBX2, da den menneskelige reference TBX2 ikke var i stand til funktionelt at erstatte det ortologe fluegen, hvilket gjorde redningsbaserede strategier umulige.

Når reference human TBX2 var overudtrykt i udviklingslandene øjet og dele af hjernen ved hjælp af eyeless Gal4, overekspression resulterer i en ca 85% dødelighed og en betydelig reduktion i øjet størrelse. I modsætning hertil er varianten transgene mindre potent i forårsager dødelighed og inducerer en lille øje fænotype ved hjælp af den samme driver under identiske eksperimentelle betingelser tyder på, at varianten påvirker protein funktion. Når et referencemenneske TBX2 overekspression i fotoreceptorerne ved hjælp af rhodopsin Gal4, forårsager overekspressionen desuden en betydelig ændring i spor af elektroretinogram.

Denne fænotype er mildere, når variantproteinet udtrykkes, hvilket giver yderligere dokumentation for, at den variant af interesse påvirker proteinfunktionen in vivo. Det er vigtigt at bemærke, at hvert gen er unikt, så der er ingen enkelt eksperiment, der kan vurdere virkningen af alle sygdoms tilknyttede varianter. Ud over at arbejde med menneskelige cDNAs, kan man også afgøre, om varianten har funktionelle konsekvenser ved at indføre analoge varianter i evolutionært bevarede rester af orthologous fluegenet.

Ved hjælp af denne metode har vi bidraget til en række undersøgelser af opdagelse af humane sygdomme i samarbejde med Det Udiagnosticerede Sygdomsnetværk og andre grupper.

X

Simple Hit Counter