Biology
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Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas primarias de cerdos en miniatura
Chapters
Summary August 14th, 2019
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Se describe un método enzimático eficaz para el aislamiento de las células endoteliales aórticas porcinas primarias (pAEC) de los cerdos en miniatura. Los pAEC primarios aislados se pueden utilizar para investigar la respuesta inmunitaria y de la coagulación en el xenotrasplante.
Transcript
El método es un método altamente eficaz para aislar células endoteliales de cerdo en miniatura. Y las células también se pueden expandir, investigar la respuesta inmune y de coagulación en el xenotrasplante. La principal ventaja de la técnica es que no sólo es fácil, altamente eficaz para aislar las células de endotelio altamente purificadas del cerdo, sino también mejor para mantener otros pAEC cuando se pasa por paso.
Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del dolor en el cerdo anestesiado, lave la pared abdominal porcina tres veces con 75% de alcohol médico y una tintura de yodo. Después del último lavado, usa un bisturí para hacer una incisión abdominal para exponer la vena cava inferior, y usa una jeringa de cinco mililitros para inyectar 5000 unidades de heparina sódica en la vena cava inferior. Después de cinco minutos, inserte un catéter en la aorta abdominal y use un bisturí para incitar el diafragma.
Con la ayuda de un segundo investigador, retire el ventrículo izquierdo y use fórceps óseos para extirpar las costillas para exponer el corazón y los pulmones. Localice la aorta posterior al corazón y los pulmones, y sujete los extremos. Use tijeras para extirpar la aorta y lávela una vez con tampón de lavado preenfriado.
Retire cualquier exceso de tejido alrededor de la aorta con fórceps estériles y tijeras, y coloque el recipiente en un tubo centrífuga de 50 mililitros que contenga tampón de lavado preenfriado fresco para su transferencia al laboratorio. Para el aislamiento de células endoteliales aórticas porcinas, transfiera la aorta del cerdo a una placa de petri de 150 milímetros en condiciones asépticas, y retire suavemente ambos extremos del recipiente. Recortar cualquier exceso de tejido adicional donde el recipiente había sido sujetado, con fórceps estériles y tijeras, y utilizar 20 a 50 mililitros de tampón de lavado fresco para enjuagar el exterior y el interior de la aorta.
A continuación, pasar una sutura quirúrgica a través de la aorta, y atar libremente un extremo del vaso, manteniendo la sutura dentro del lumen. Fije suavemente la aorta cerca del extremo atado con fórceps y luego tire de la sutura quirúrgica lentamente, para invertir la aorta, hasta que la superficie endotelial de la aorta esté expuesta. Lave la superficie endotelial de la aorta tres veces con 10 mililitros de tampón de lavado fresco por lavado, y coloque la aorta en un tubo centrífugo de 15 mililitros.
Cubrir la muestra con 10 mililitros de 37 grados Celsius calentados 0.005%solución digestiva de colagenasa IV, e incubar el tejido a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Al final de la incubación, transfiera todo el contenido del tubo a un plato de cultivo de 100 milímetros, y detenga la digestión con 10 a 15 mililitros de tampón de parada preenfriado. Con un rascador de células, retire suavemente las células endoteliales aórticas de la superficie interior del recipiente y lave el recipiente tres veces con cinco mililitros de tampón de lavado por lavado.
Después del último lavado, transfiera el sobrenadante a un tubo centrífugo de 50 mililitros, y lave el fondo del plato de cultivo dos veces con cinco mililitros de tampón de lavado fresco, por lavado, tirando de los lavados en el tubo de 50 mililitros. Recoger las células por centrifugación, y descartar todos menos los últimos 10 mililitros de sobrenadante. Añadir 20 mililitros de tampón de lavado para resuspender el pellet, teniendo cuidado de evitar burbujas, y recoger las células con otra centrifugación.
Resuspender el pellet en un mililitro de medio de cultivo celular para el recuento, y placar las células a una vez diez a las seis células por 25 centímetros de concentración de matraz cuadrado. Luego coloque las células en la incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius en 5%dióxido de carbono, refrescando el medio cada dos a tres días. Después del aislamiento, las células endoteliales se inspeccionan en el día cero, uno y dos, y después de los pasajes uno y dos para la contaminación y su evaluación morfológica.
El análisis citométrico de flujo utilizando un anticuerpo anti-CD31-FITC indica una población positiva típicamente superior al 97%marcador de células endoteliales en el tercer día del cultivo, que se mantiene a una pureza superior al 90% incluso después de dos pasajes. La superficie endotelial de la aorta fue raspada en una sola dirección, con un rascador de células, por menos de 10 veces, y no se comprimió durante el proceso de raspado. Mejor respuesta, método optimizado de aislamiento pAEC, podemos utilizar pAEC purificados para realizar experimentos individuales e investigar el rechazo inmune y la respuesta de coagulación en xenotrasplante.
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