Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Micromanipulation af cirkulerende tumor celler til downstream Molekylær analyse og metastatisk potentiel vurdering
Chapters
Summary May 14th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en integreret arbejdsgang for at identificere fænotypiske og molekylære funktioner, der karakteriserer cirkulerende tumorceller (Ctc'er). Vi kombinerer levende immun farvning og robot-micromanipulation af enkelt-og klynge-Ctc'er med enkelt celle-baserede teknikker til downstream analyse og vurdering af metastaser-såning evne.
Transcript
Denne protokol er særlig relevant, fordi den gør det muligt at detektion og udvælgelse af enkelte celler fra en pulje af blandede celler til efterfølgende downstream-analyse ved en enkelt celleopløsning. Den største fordel ved denne teknik er potentialet til at adskille individuelle cirkulerende tumorceller, eller CTC'er, fra blodlegemer til en række analyser, der kræver høj renhed. Begynd med at starte mikromanipulatorsoftwaren og tænde for mikromanipulatoren.
Tilslut mikromanipulatoren til computeren, og klik på Tilslut og initialiser enheden for at initialisere robotarmen i mikroskopfasen. Rengør beskyttelsesskabets udvendige og indvendige overflader med ethanol, og luk beskyttelsesskabet efter hver manipulation af maskinen for at kunne manøvrere enheden gennem computeren. Installer en ny 20 til 30 mikrometer glas kapillær på robotarmen og skyl systemolie gennem systemet for at fjerne eventuelle bobler i slangen.
Fyld sterilisation tank en med 70% ethanol, sterilisation tank to med sterile nuklease-fri vand, og buffertanken med sterile Dulbecco's PBS. Sterilisere kapillær to gange med 70% ethanol og erstatte sterilisation tank en med sterilisation tank to til at bruge sterilisation funktion til at vaske kapillær i vand mindst tre gange. I mikromanipulatorsoftwaren skal du starte et nyt eksperiment og vælge den type plukforsøg fra de automatiske og manuelle udvælgelsestilstande.
Konfigurer dækbakken til at angive placeringen af sterilisationstanken, buffertanken og aflejringsbakken, og indstil temperaturen på væsketankene i den valgte deponeringsbakke til fire grader Celsius. Placer en ultralav fastgørelsesplade, der indeholder den frigivne CTC-opløsning under mikroskopet inde i mikromanipulatorskabet. Tag låget af pladen og luk skabet.
Centrifuge en 384-brønd plade, der indeholder 20 mikroliter CTC kultur medium per brønd for at sikre, at mediet er afsondret i bunden af hver brønd og placere pladen i målet en position af de fire grader Celsius valgte deponering bakke. Vælg mikroskopmålet manuelt for plukning og eksponeringstiden for alle de nødvendige kanaler. Vælg Vis godt navigator for at visualisere og vælge typen af afhentningsplade.
Kalibrer derefter en afhentningsposition midt i brønden, der indeholder CTC-opløsningen uden celler i midten af synsfeltet. Brug sensoren til forsigtigt at røre ved bunden af pladen med en kapillær og indstille opsamlingspositionen til 0,05 millimeter over bunden af pladen. Sænk forsigtigt robotarmen med 10 mikrometer ad gangen for at undgå at beskadige kapillæren.
Markér celletype- og plukparametrene. Vælg manuel tilstand for pluk af en enkelt celle. Brug joysticket til at navigere i glaskapillary i brønden og placere kapillær på toppen af en enkelt celle af interesse mindst en millimeter fra brønden grænsen.
Derefter manuelt tilføje partikler og vælg Pick aktiverede partikler for at starte plukning. Når alle cellerne er plukket, centrifuge pladen til sediment cellerne i bunden af hver brønd. Bio-amino farvning med anti-epitelcelle adhæsion molekyle antistof giver mulighed for visualisering af kræftceller i suspensionen med en nøjagtig skelnen fra CD45 positive hændelser.
Præcis CTC isolation er kendetegnet ved aspiration af kun det ønskede mål uden de omkringliggende forurenende celler. Som mistænkt viser CTC-klynger en øget overlevelse sammenlignet med enkelte CTC'er, hvilket giver anledning til cellekolonier inden for 56 dage efter in vitro-kulturen. Især CTC klynger også udviser en højere spredning sats og dermed nå højere endelige celletal, hvilket indikerer, at den direkte kontakt med andre tumorceller har en indvirkning på både tumorcelle levedygtighed og spredning sats.
Single-celle RNA sekventering af CTC direkte isoleret fra brystkræft patienter afslører en T-distribueret stokastisk nabo indlejring af enkelt-celler stammer fra enkelt CTC,CTC klynger, eller CTC hvide blodlegemer klynger. Husk at installere glaskapillaryen for at fjerne luftbobler i mikromanipulatorens flydende system og kalibrere afhentningspositionen for at sikre en effektiv enkeltcelleplukning. Enkeltcellerne kan sås eller viderebearbejdes til næste generations sekvensering for at muliggøre ex vivo-analyse og CTC-karakterisering ved en enkeltcelleopløsning for at undersøge den metastatiske proces.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
