Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Mikromanipulering av sirkulerende tumor celler for nedstrøms molekylær analyse og metastatisk potensiell vurdering
Chapters
Summary May 14th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenterer vi en integrert arbeidsflyt for å identifisere fenotypiske og molekylære funksjoner som karakteriserer sirkulerende tumorceller (CTC). Vi kombinerer Live immunostaining og Robotic mikromanipulering av singel og gruppert CTC med én celle-baserte teknikker for nedstrøms analyse og vurdering av metastasering-seeding evne.
Transcript
Denne protokollen er spesielt relevant fordi den tillater deteksjon og valg av enkeltceller fra et utvalg av blandede celler for etterfølgende nedstrøms analyse ved en enkelt celleoppløsning. Den største fordelen med denne teknikken er potensialet til å skille individuelle sirkulerende tumorceller, eller CTCer, fra blodceller for en rekke analyser som krever høy renhet. Begynn med å starte opp mikromanipulatorprogramvaren og slå på mikromanipulatoren.
Koble mikromanipulatoren til datamaskinen, og klikk på Koble til og initialiser enheten for å initialisere robotarmen i mikroskopstadiet. Rengjør de ytre og indre overflatene på beskyttelsesskapet med etanol og lukk beskyttelsesskapet etter hver manipulering av maskinen for å kunne manøvrere enheten gjennom datamaskinen. Monter en ny 20 til 30 mikrometerglasskapillær på robotarmen og skyll systemolje gjennom systemet for å fjerne eventuelle bobler i slangen.
Fyll steriliseringstanken en med 70% etanol, steriliseringstank to med sterilt kjernefritt vann, og buffertanken med steril Dulbeccos PBS. Steriliser kapillæren to ganger med 70 % etanol og erstatt steriliseringstanken én med steriliseringstank to for å bruke steriliseringsfunksjonen til å vaske kapillæren i vann minst tre ganger. I mikromanipulatorprogramvaren starter du et nytt eksperiment og velger typen plukkeksperiment fra de automatiske og manuelle valgmodusene.
Konfigurer dekksbrettet for å angi posisjonene til steriliseringstanken, buffertanken og deponeringsbrettet, og sett temperaturen på væsketankene i det valgte deponeringsbrettet til fire grader Celsius. Plasser en ultra-lav festeplate som inneholder den frigjorte CTC-løsningen under mikroskopet inne i mikromanipulatorskapet. Fjern lokket fra platen og lukk kabinettet.
Sentrifuge en 384-brønnsplate som inneholder 20 mikroliter CTC-kulturmedium per brønn for å sikre at mediet er beslaglagt nederst på hver brønn og plasser platen i målet en posisjon av de fire grader Celsius valgt deponeringsbrett. Velg mikroskopmålet manuelt for plukking og eksponeringstiden for alle nødvendige kanaler. Velg Vis velvelger for å visualisere og velge typen henteplate.
Kalibrer deretter en henteposisjon midt i brønnen som inneholder CTC-løsningen uten celler i midten av synsfeltet. Bruk sensoren til å berøre bunnen av platen forsiktig med kapillær og sett pickupposisjonen til 0,05 millimeter over bunnen av platen. Senk robotarmen forsiktig med 10 mikrometer om gangen for å unngå å skade kapillæren.
Velg celletypen og plukkparameterne. Velg manuell modus for plukking av én celle. Bruk joysticken til å navigere glasskapillæren i brønnen og plassere kapillæren på toppen av en enkelt celle av interesse minst en millimeter fra brønnkanten.
Deretter legger du til partikler manuelt og velger Velg aktiverte partikler for å starte plukkingen. Når alle cellene er plukket, sentrifuger platen for å sedimentere cellene nederst på hver brønn. Bio-amino farging med anti-epitelcelle vedheft molekyl antistoff tillater visualisering av kreftceller i suspensjonen med et nøyaktig skille fra CD45 positive hendelser.
Presis CTC-isolasjon er preget av aspirasjonen av bare det ønskede målet uten de omkringliggende forurensningscellene. Som mistenkt viser CTC-klynger en økning i overlevelsen sammenlignet med enkelt CTCer, noe som gir opphav til cellekolonier innen 56 dager etter in-vitro-kulturen. Spesielt viser CTC-klynger også en høyere spredningshastighet og når dermed høyere endelige celletall, noe som indikerer at direkte kontakt med andre tumorceller har innvirkning på både tumorcelle levedyktighet og spredningshastighet.
Encellede RNA-sekvensering av CTCer direkte isolert fra brystkreftpasienter avslører en T-distribuert stokastisk naboinnbygging av enkeltceller avledet fra enkelt CTCer, CTC-klynger eller CTC-klynger i hvite blodlegemer. Husk å installere glasskapillæren for å fjerne luftbobler i mikromanipulatorens fluidiske system og kalibrere henteposisjonen for å sikre en effektiv enkeltcelleplukking. Enkeltcellene kan seedes eller behandles videre for neste generasjons sekvensering for å muliggjøre ex-vivo-analyse og CTC-karakterisering med en enkeltcelleoppløsning for å undersøke den metastatiske prosessen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
