Neuroscience
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Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs
Chapters
Summary May 23rd, 2019
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Ici, nous présentons un protocole qui utilise des colorants quasi-infrarouges en conjonction avec l’immunohistochimie et la numérisation à haute résolution pour les protéines de dosage dans les régions du cerveau.
Transcript
Ce protocole est significatif parce qu’il permet la quantification de deux protéines dans la même région du cerveau. Cela permet à l’expérimentateur d’examiner l’activité dans les voies de signalisation moléculaire dans les régions du cerveau en testant les pans et les phosphoprotéines. Il peut également être utilisé pour apaiser les protéines qui sont des marqueurs de différents phénomènes cognitifs.
Nous utilisons une technique relativement simple, comme l’immunohistochimie, pour répondre à des questions qui nécessitent généralement des techniques plus impliquées. Y compris l’examen de l’activité des voies de signalisation moléculaire, l’examen du rapport AMPA/NMDA. À l’aide d’un cryostat maintenu entre moins 9 degrés Celsius et moins 12 degrés Celsius, trancher le cerveau de rat précédemment isolé et congelé dans les régions d’intérêt à 30-50 micromètres.
Monter directement les tranches sur des glissières en verre et les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’immunocytochimie. Retirer les glissières de verre du congélateur et leur permettre d’équilibrer à température ambiante pendant 30 minutes. En travaillant sous un capot de fumée, placez les glissières dans 4% de paraformaldéhyde dans 0,1 molaire PBS pendant une à deux heures à température ambiante pour la fixation des tissus.
Rincez ensuite les glissières dans 0,1 tos molaire trois fois pendant 10 minutes chacune. Pour perméabiliser les membranes cellulaires, incuber les glissières dans un détergent doux pendant 30-60 minutes. Et rincer à nouveau dans tbs trois fois pendant 15 minutes chacun.
Diluer l’anticorps primaire pour la protéine d’intérêt dans PBS dans la concentration correcte telle que décrite dans le manuscrit. Pipette solution d’anticorps primaires directement sur le tissu cérébral. Placez des glissements de couverture sur les glissières et incubez le tissu cérébral dans la dilution primaire d’anticorps pendant 1-2 heures à température ambiante.
Après l’incubation, retirer les feuillets de couvercle et laver les glissières dans le SCT qui a une petite quantité de détergent ajouté à elle, quatre fois pendant 15 minutes chacun. Diluer l’anticorps secondaire dans un diluant contenant du SCT, du détergent et 1,5 % du sérum hôte. Ajouter l’anticorps secondaire aux glissières, couvrir de glissements de couvercle et incuber à température ambiante pendant deux heures.
Après l’incubation, rincer les glissières dans le TBS-T quatre fois pendant 20 minutes chacune, puis dans le SCT quatre fois pendant 20 minutes chacun. Séchez les glissières à température ambiante dans l’obscurité, pendant la nuit. Placez les diapositives sur l’interface de balayage proche infrarouge avec le tissu orienté vers le bas.
Imagez plusieurs diapositives à la fois à l’aide de l’outil de sélection. Imagez les diapositives en utilisant le réglage de la plus haute qualité avec une résolution de 21 micromètres. Dans un décalage de zéro nanomètre, importer des images dans un logiciel d’analyse d’image pour afficher et marquer l’analyse des protéines semiquantitatives.
Après l’ouverture du logiciel d’analyse d’image, sélectionnez la zone de travail dans laquelle l’image a été numérisée. Ouvrez ensuite l’image numérisée dans le logiciel d’analyse d’image pour afficher l’analyse et ajuster les longueurs d’onde, le contraste, la luminosité et le grossissement affichés sans altérer l’image brute ou l’émission quantifiée totale. Après avoir identifié les régions clés pour la quantification, sélectionnez l’onglet analyse le long du haut de la page, puis sélectionnez le rectangle de tirage pour dessiner un rectangle sur la zone qui sera quantifiée.
Pour afficher la taille du rectangle, sélectionnez les formes le long du bas à gauche de l’écran. Sélectionnez ensuite les colonnes en bas à droite. Ajoutez ensuite des colonnes de hauteur et de largeur pour identifier la taille de la forme.
Enfin, nommez la forme et répétez. Une fois que toutes les régions sont échantillonnées, procédez à la combinaison et à l’analyse des données disponibles à partir de l’onglet colonnes. Pour vérifier que ce protocole fonctionne, les sections cérébrales ont été incubées avec des anticorps primaires et secondaires, des anticorps secondaires seuls, ou ni anticorps primaires ni secondaires.
L’expression précoce immédiate de c-jun de gène a été détectée dans l’hippocampe dorsal et l’amygdale seulement quand les anticorps primaires et secondaires ont été appliqués au tissu de cerveau. La sous-unité GluR1 du récepteur AMPA et la sous-unité NR2A du récepteur NMDA ont été analysées dans la détection des protéines des selles dans les noyaux d’amygdale. Cela a permis d’examiner le rapport des récepteurs AMPA NMDA dans les sous-noyaux de l’amygdale qui est une signature neurobiologique de l’apprentissage et de la mémoire.
Des mesures moyennes et normalisées de l’expression des protéines ont été obtenues à partir de balayages à haute résolution dans l’hippocampe ventral. À l’aide du logiciel d’analyse d’image, un rectangle est placé dans la région d’intérêt et l’intensité moyenne de la lumière de la forme a été utilisée comme mesure de l’expression fluorophore, qui est une mesure de l’expression des protéines. Pour obtenir la courbe normalisée, une forme a été placée à travers une région qui exprime un signal élevé et un signal faible dans la zone sous la courbe a été utilisé comme mesure de l’expression des protéines.
La plus grande lutte avec cette procédure est de trouver un anticorps et de s’assurer qu’il fonctionne. L’application est simple. Mon conseil serait d’abord de tenter une procédure immunohistochimique régulière, puis d’essayer cette technique.
Toujours effectuer un test de validation d’abord. La chose la plus importante à retenir est de vérifier votre dilution des anticorps et assurez-vous qu’il est appliqué correctement. Sans ces étapes, la procédure échouera.
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