Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Beoordeling van de vasculaire Toon responsiviteit met behulp van geïsoleerde mesenterica slagaders met een focus op modulatie door Perivasculaire vetweefsel
Summary June 3rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het protocol beschrijft het gebruik van draad myography te evalueren van de Transmurale isometrische spanning van mesenterica slagaders geïsoleerd van muizen, met speciale aandacht voor de modulatie door factoren vrijkomen van endothelial cellen en perivasculaire vetweefsel.
Transcript
Er is een zeer strikt protocol vereist, zodat we preparaten van dezelfde dieren of van verschillende dieren of slagaders op geldige wijze kunnen vergelijken in de aanwezigheid of afwezigheid van het vet eromheen of in de aanwezigheid of afwezigheid van het endotheel. Het belangrijkste voordeel van deze experimentele techniek is dat we ringen van dezelfde slagader onder isometrische toestand kunnen vergelijken en dus op geldige wijze conclusies kunnen trekken over de impact van de experimentele factoren die we onderzoeken. Dit protocol biedt inzicht in modulatie van vasculaire responsiviteit door perivasculaire vetweefsels van verschillende genetisch gemodificeerde dieren.
Vetweefsel disfuncties vertegenwoordigen een onafhankelijke risicofactor voor hypertensie en de bijbehorende cardiovasculaire complicaties. Onze myograaf omvat meerdere ingewikkelde stappen die op elk punt uiterste voorzichtigheid vereisen om te voorkomen dat het vat beschadigd wordt, vooral tijdens de montage, en om ervoor te zorgen dat het vat adequaat reageert op verschillende stimuli. Begin deze procedure met preparaten en dissectie van de mesenterische arteriële ringen zoals beschreven in het tekstprotocol.
Schakel de computer in en open de software voor het opnemen van gegevens. Sla het experiment op als een gegevensbestand met een labdiagram met een nieuwe naam om te voorkomen dat het oorspronkelijke instellingsbestand wordt overschrijft. Open het venster normalisatie-instellingen en stel de K-factor in op één.
Accepteer de standaardwaarden voor ip-kalibratie, doeldruk, online gemiddelde tijd en vertragingstijd. Klik op oke om de instellingen op te slaan. Selecteer kanalen van belang en voer de draaddiameter, weefseleindpunten en de eerste micrometermeting in het normalisatievenster in.
Om de normalisatieprocedure te starten, breng je de eerste passieve stretch op het bloedvat aan door de micrometerschroef tegen de klok in te draaien. Na drie minuten wachten tot het vat stabiliseert, voert u de nieuwe micrometermeting in het normalisatievenster in. De wandspanning wordt automatisch berekend en weergegeven als een punt op de grafiek.
Vervang na elke passieve stretch de controlebuffer door een iso-osmotische hoge kaliumreulpen met 150 millimolar kaliumchloride. Wanneer de samentrekking op ongeveer drie minuten een plateau bereikt, registreert u de actieve kracht door de passieve kracht op elk rek af te trekken van de kaliumgeactiveerde kracht. Bereken de muurspanning, evenals de interne omtrekwaarden.
Verwijder de hoge kaliumconditie door de hoge kaliumbuffer te vervangen door verse krebs buffer. Herhaal het wassen gedurende drie keer gedurende vijf minuten. Herhaal de normalisatiestappen door passieve rekturen te induceren, gevolgd door actieve samentrekking in alternatieve bochten totdat de actieve spanning begint te dalen.
Grondig wassen van de hoge kalium krebs buffer en equilibrate de voorbereidingen voor nog eens 30 tot 45 minuten. Stel de basale spanningen terug op nul, zodat tijdens het volgende experiment alleen actieve contractiele reacties worden geregistreerd. Voorbereiden en monteren gekoppelde slagaderringen zoals beschreven in het tekstprotocol van de aangrenzende delen van elke slagader.
Bereid een slagaderlijke ring met PVAT intact en de andere met PVAT verwijderd. Na normalisatie, precontract de arteriële segmenten met hoge kalium krebs buffer door het toevoegen van 115 millimolar kaliumchloride oplossing aan de kamer met krebs. Na samentrekking aan de plateauperiode, was het hoge kalium en vervang de buffer door verse beluchte krebsbuffer.
Herhaal het wassen drie keer over vijf minuten. Herhaal de stimulatie en het wassen van kaliumchloride drie keer en nota van de maximale contractielrespons op kaliumchloride door de basislijnspanning af te trekken van de spanning als gevolg van kaliumchloridestimulatie. Na de laatste samentrekking en wassen, vul de kamer met warme, bereden krebs buffer en laat de slagader te herstellen voor ongeveer 30 minuten voor het uitvoeren van de volgende taak.
Voeg aan elke kamer cumulatieve hoeveelheden fenylephrine toe om de concentratieafhankelijke verhogingen en isometrische spanning van de rustige preparaten te induceren. Na het toevoegen van de laatste dosis agonist, was het medicijn grondig en vul de kamer met verse krebs buffer. Plot de concentratieafhankelijke reacties als toenemende percentages van het kaliumchloride geïnduceerde maximale contracties.
Om de bijdrage van stikstofmonoxide te beoordelen, broedt u de preparaten met de stikstofmonoxidesynase-remmer L-NAME gedurende 30 minuten voor de toevoeging van fenylephrine uit. Voor het uitvoeren van een tweede concentratieresponscurve achtereenvolgens, was de kamer volledig en herhaaldelijk om alle vorige agonisten te verwijderen totdat er geen verdere veranderingen in de toon worden waargenomen. Normalisatie van de lengte-spanning relatie werd uitgevoerd voor mesenterische slagaders geïsoleerd van muis modellen gevoed met standaard chow of een vetrijk dieet.
Een passieve lengte-spanningsverhouding werd gevestigd door stapsgewijs uitrekken van de slagadersegmenten tot een interne omtrek die overeenkomt met 100 millimeter kwiktransmurale druk, of IC100, werd verkregen. Na elk stuk werd 115 millimolar kaliumchloride toegepast om samentrekkingen te stimuleren. De actieve lengtespanningscurven werden uitgezet op basis van de actieve krachtgegevens op de Y-as en de berekende IC-waarden van de micrometergegevens op de X-as.
Een IC-waarde die in het piekplateau ligt, is IC1. De normalisatiefactor, K, werd berekend als de verhouding van IC1 en IC100, die vervolgens in het volgende experiment kon worden toegepast op monsters van hetzelfde vattype. Hier getoond zijn output opnames van de vasoconstrictor reacties op fenylephrine in mesenterische slagaders met of zonder omringende PVAT.
Cumulatieve concentraties fenylephrine werden toegepast om de samentrekkingen van mesenterische slagaders verzameld van 16 weken oude adiposet een muizen te stimuleren. De contractiele reacties werden geregistreerd en berekend als een percentage van 150 millimolar kaliumchloride geïnduceerde maximale contractie. Het gebied onder de samentrekkingskrommes werd uitgezet voor vergelijking.
Merk op dat PVAT van adiposet een muizen ontlokte een anti-contractiel effect op de reactie op fenylephrine. Bij het verkrijgen van door KCL geïnduceerde contracties moeten de antwoorden stabiel en stabiel zijn. Als de respons na drie incrementele toedieningen van KCL nog steeds toeneemt, kan KCL-stimulatie nodig zijn.
Om optimale omstandigheden van de spanningen te bereiken, is de normalisatiestap erg belangrijk, omdat dit de kracht bepaalt om de bloedvaten te openen. Als het niet goed wordt gedaan, zal het het hele experiment beïnvloeden. Dit protocol kan worden toegepast op andere instellingen in aanvulling op phenylephrine-geïnduceerde contractie of ontspanning.
Bijvoorbeeld, in de aanwezigheid of afwezigheid van perivasculair vetweefsel, autonome zenuwen, of endotheel. Met dit protocol kunnen onderzoekers kleine bloedvaten onderzoeken van zieke diermodellen onder verschillende pathofysiologische aandoeningen, zoals obesitas, diabetes en hart- en vaatziekten.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
