Neuroscience
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Rodent मस्तिष्क में Subcellular Ubicuitin-proteasome गतिविधि की मात्रा
Chapters
Summary May 21st, 2019
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इस प्रोटोकॉल को कृंतक मस्तिष्क के विभिन्न सेलुलर डिब्बों में सर्वव्यापक-प्रोटेसोम सिस्टम (यूपीएस) गतिविधि को कुशलतापूर्वक परिमाणित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। उपयोगकर्ताओं को एक ही जानवर में परमाणु, साइटोप्लाज्मिक और synaptic भिन्न में यूपीएस कार्य की जांच करने में सक्षम हैं, समय और इन जटिल विश्लेषण करने के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या की मात्रा को कम करने.
Transcript
यह प्रोटोकॉल कृंतक मस्तिष्क में उपकोशिकीय प्रोटीन सर्वव्यापी स्तर और प्रोटेसोम गतिविधि को मापता है जो विषयों की तुलना के भीतर अनुमति देता है कि सेलुलर गतिविधि, सीखने या बीमारी के जवाब में सर्वव्यापी-प्रोटीसोम गतिविधि कैसे बदलती है। प्रोटोकॉल एक ही कृंतक मस्तिष्क से सिनैप्टिक, साइटोप्लाज्मिक और परमाणु अंशों के संग्रह की अनुमति देता है। नुकसान को कम करने, यह छोटे ऊतक मात्रा और बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों के साथ किया जा सकता है।
प्रक्रिया का प्रदर्शन टेलर McFadden, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा । पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित कृंतक मस्तिष्क ऊतक के संग्रह और विच्छेदन के साथ इस प्रक्रिया को शुरू करें। सुनिश्चित करें कि उपयोग किया जाने वाला गोलार्द्ध प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए निष्कर्षण स्थितियों में संतुलित काउंटर है।
माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ब्याज के क्षेत्र के एक गोलार्द्ध युक्त 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज माइक्रोट्यूब को हटा दें। एक स्केलपेल का उपयोग करके, जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों को दो मिलीलीटर ग्लास टेफ्लॉन होमोजेनाइजर में स्थानांतरित करें। टेफ्लॉन ट्यूब में लाइसिस बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।
मूसल बी का उपयोग करना, 15 स्ट्रोक के साथ एक ही ऊतक समरूप जब तक ठोस सामग्री की कोई दिखाई राशि मौजूद है । प्रत्येक स्ट्रोक के दौरान एक टर्निंग मोशन का प्रयोग करें। 1, 000 माइक्रोलीटर पिपेट के साथ, समरूप नमूने को एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
ट्यूब को गीली बर्फ पर रखें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ट्यूब को माइक्रोसेंट्रफ्यूज में रखें और चार डिग्री सेल्सियस में 845 गुना जी पर 10 मिनट के लिए स्पिन करें। पूरा होने के बाद, ध्यान से पिपिंग द्वारा सुपरनेट्ट को हटा दें और एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें।
यह साइटोप्लाज्मिक अंश है। परिणामी गोली और पिप्टिंग द्वारा resuspend करने के लिए निष्कर्षण बफर के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। गोली को भंवर न करें।
बर्फ पर पुनः निलंबित गोली युक्त ट्यूब रखें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद ट्यूब को 21, 456 बार चार डिग्री सेल्सियस में 20 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज करें। अपकेंद्रित्र के बाद, ध्यान से पाइपिंग द्वारा सुपरनेट्ट को हटा दें और एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें।
यह परमाणु अंश है । लाइसिस बफर के बजाय तेईवीपी बफर के 500 माइक्रोलीटर का उपयोग करने के अलावा ब्याज के क्षेत्र के एक गोलार्द्ध को पहले की तरह समरूप करें। 1, 000 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके, समरूप नमूने को एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर नमूना अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को इकट्ठा करें और इसे 1, 000 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10, 000 बार जी पर नमूना अपकेंद्रित्र।
मूल गोली जो नाभिक और बड़े मलबे होता है त्यागें। सुपरनेट को एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। यह साइटोसोलिक अंश है।
गोली में समरूपता बफर के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और जब तक कोई ठोस सामग्री दिखाई न दे, तब तक पिपटिंग करके पुनर्व्यवस्रित करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20, 000 बार जी पर नमूना अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
यह क्रूड सिनेप्टोसोमल झिल्ली अंश है। परख स्थापित करने के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए थाली पाठक prewarm और रन के माध्यम से पकड़ो । 460 नैनोमीटर के लिए 360 नैनोमीटर और उत्सर्जन करने के लिए उत्साह सेट करें।
यदि उपयोग की जाने वाली 96 अच्छी प्लेट स्पष्ट है, तो प्रकाशिकी की स्थिति को नीचे सेट करें। यदि एक अंधेरे 96 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग किया जाता है, तो शीर्ष पर प्रकाशिकी की स्थिति निर्धारित करें। कार्यक्रम हर 30 मिनट स्कैनिंग दो घंटे के समय के साथ एक गतिज रन ।
अल्ट्रापुरे पानी के 13.5 मिलीलीटर के साथ किट में प्रदान किए गए 20S 10X परख बफर का पुनर्गठन करें। अब 1X बफर में 100 मिलीमोलर एटीपी के 14 माइक्रोलीटर जोड़ें। यह नमूनों में प्रोटेसोम गतिविधि को काफी बढ़ाता है और परख विश्वसनीयता में सुधार करता है।
डीएमएसओ के 100 माइक्रोलीटर के साथ किट में दिए गए एएमसी मानक का पुनर्गठन करें। अंधेरे में या कम रोशनी की स्थिति में एएमसी मानक का उपयोग करके कदम उठाएं क्योंकि मानक हल्का संवेदनशील है। उच्च से कम एएमसी सांद्रता की एक श्रृंखला से एएमसी का एक मानक वक्र बनाएं।
इस वक्र का उपयोग प्लेट रीडर अंशांकन और समरूप नमूनों में प्रोटेसोम गतिविधि के विश्लेषण के लिए किया जाएगा। डीएमएसओ के 65 माइक्रोलीटर के साथ किट में दिए गए प्रोटेसोम सबट्रेट का पुनर्गठन करें। इसके अलावा अंधेरे में या कम प्रकाश की स्थिति में इस कदम के रूप में सब्सट्रेट प्रकाश संवेदनशील है प्रदर्शन करते हैं ।
फिर 20S परख बफर का उपयोग करके एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में प्रोटीसोम सब्सट्रेट का एक से 20 कमजोर होना। एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में वांछित नमूनों की एक सामान्यीकृत मात्रा जोड़ें। प्रत्येक नमूना को डुप्लीकेट में चलाएं।
आवश्यक नमूने की मात्रा ऊतक तैयारी के आधार पर भिन्न होती है। आम तौर पर, किसी भी उपकोशिकीय अंश के लिए 10 से 20 माइक्रोग्राम पर्याप्त होता है। नमूना अच्छी तरह से मात्रा अल्ट्रापुरे पानी के साथ 80 माइक्रोलीटर के लिए लाओ।
जोड़ा गया राशि जोड़ा गया नमूना की मात्रा पर निर्भर करता है। दो अलग-अलग कुओं में अकेले 80 माइक्रोलीटर पानी डालें। ये परख रिक्त स्थान होंगे।
परख रिक्त स्थान सहित प्रत्येक अच्छी तरह से 20S परख बफर के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। कुओं में लगातार परख की मात्रा सुनिश्चित करने के लिए एक रिपीटर या स्वचालित पिपेट का उपयोग करें। रोशनी बंद कर दें या एक अंधेरे कमरे में प्रवेश करें।
प्रत्येक मानक के लिए एक ही अच्छी तरह से उपयोग कर एक नई अच्छी तरह से पतला एएमसी मानकों के सभी 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। अंधेरे में, एक रिपीटर या स्वचालित पिपेट का उपयोग नमूने और परख रिक्त स्थान वाले कुओं में पतला प्रोटीटेम सब्सट्रेट के 10 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए करें लेकिन एएमसी मानक नहीं। प्लेट रीडर में प्लेट रखें और गतिज रन शुरू करें।
अद्वितीय लिंकेज-विशिष्ट पॉलीव्यापकिन एंटीबॉडी के संयोजन में विभिन्न मानक पश्चिमी ब्लॉटिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके कृंतक मस्तिष्क ऊतक से एकत्र विभिन्न उपकोशिकीय अंशों में विविध पॉलीबिस्टेलिन टैग का मात्राकरण करें। कुछ सर्वव्यापक पश्चिमी दाग छवियों अलग बैंड के कॉलम प्रदान करेगा, जबकि दूसरों को कुछ या कोई स्पष्ट लाइनों के साथ धब्बा की तरह पैटर्न का उत्पादन । पश्चिमी धब्बे के चित्रित सर्वव्यापकता के मात्राकरण के लिए, कॉलम के चारों ओर एक बॉक्स खींचें जो पूरे आणविक मानकों की सीढ़ी का विस्तार करता है।
बॉक्स को समायोजित करें यदि सर्वव्यापी धुंधला पूरी सीढ़ी के माध्यम से विस्तार करता है। यह lysine 48 संशोधनों के लिए आम है और उपकोशिकीय डिब्बों में व्यापक रूप से भिन्न होता है। अंत में, पृष्ठभूमि को घटाएं जिसकी गणना पृष्ठभूमि के मतलब ऑप्टिकल घनत्व के रूप में तुरंत सभी पक्षों पर कॉलम के आसपास की जाती है।
यहां दिखाया गया है कि एक ही जानवर के पार्श्व एमिग्डाला से एकत्र विभिन्न अंशों में प्रोटेसोम गतिविधि का मात्राकरण है। इन विट्रो प्रोटेसोम गतिविधि परख के दौरान, सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों का पता चला, जो शुरुआत से सिनैप्टिक अंश, साइटोप्लाज्मिक अंश और परमाणु अंश में परख के अंत तक बढ़ गया। प्रोटीसोम अवरोधक बीटा-लाख ने आरयू को पूरे सत्र में बदलने से रोका ।
एक ही जानवर के पार्श्व एमिग्डाला में प्रोटेसोम गतिविधि में उपकोशिकीय मतभेद देखे गए। नियंत्रण के सापेक्ष प्रशिक्षित जानवरों में परमाणु प्रोटेसोम गतिविधि में वृद्धि का पता चला जो सिनैप्टिक अंश के भीतर गतिविधि में कमी से मेल खाती थी। साइटोप्लाज्मिक प्रोटीसोम गतिविधि बेसलाइन पर बनी रही।
यहां दिखाया गया है कि सीखने के बाद एक ही जानवर के पार्श्व एमिग्डाला में लिंकेज-विशिष्ट प्रोटीन सर्वव्यापी में उपकोशिकीय अंतर हैं। सीखने के बाद परमाणु अंश में समग्र सर्वव्यापकता में वृद्धि हुई जो साइटोप्लाज्मिक अंश में कमी के साथ सहसंबद्ध थी। सीखने के बाद, रैखिक सर्वव्यापी परमाणु अंश में वृद्धि हुई लेकिन साइटोप्लाज्मिक या सिनैप्टिक अंश नहीं।
दिलचस्प बात यह है कि K63 सर्वव्यापकता सीखने के बाद परमाणु अंश में वृद्धि हुई जो सिनैप्टिक अंश में कमी के साथ सहसंबद्ध है। जबकि K48 एकसंहण सीखने के बाद परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों में वृद्धि हुई है लेकिन सिनैप्टिक अंश में नहीं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक ही जानवर के भीतर अन्य प्रोटीन के उपकोशिकीय वितरण और कार्य को समझने के लिए भी किया जा सकता है।
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