Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Vores protokol beskriver metoder til effektiv ekspression og rensning af FAH domæne, der indeholder proteiner, men også proteiner i almindelighed. FHD protein-1 spiller en regulerende rolle i TCA cyklus og energi metabolisme af mitokondrier. Vi var i stand til at knytte FHD-1 downregulation til cellulære senescens og oplysninger om enzymaktivitet og proteinstruktur er generelt nødvendige for at forstå molekylære mekanismer bag observerede fænotyper.

Den største fordel ved at udtrykke proteiner via IPTG inducerende vektorsystemer er, at alle metoder er relativt billige og nemme at etablere i ethvert laboratorium. Ved at anvende poly-histidin type proteiner i kombination med nikkel NTA agarose harpiks, den enorme selektivitet af affinitetkromatografi kan anvendes til lave omkostninger. Til de fleste formål, protein fremstillet ved denne kvalitet kan allerede være tilstrækkeligt.

FPLC på de andre hænder, er en veletableret og generel metode med flere fordele i forhold til andre metoder. Først indsætte fem til 10 nanogram plasmid i 100 mikroliter af kompetente BL21-DE3 pLysS E.coli bakterier på is. Let banke på røret for at blande indholdet.

Hold bakterierne på is i 30 minutter, forsigtigt trykke røret med få minutters mellemrum. Varm en termokande til 42 grader celsius. Rør, der indeholder bakterierne, anbringes i apparatet og opvarmes i 90 sekunder.

Derefter placere røret på isen med det samme. Efter fem til 10 minutter på is, tilsæt 600 mikroliter af NZCYM medium og læg røret i en bakterieinkubator. Ryst røret ved medium hastighed orienteret langs rysteretningen ved 37 grader celsius i en time.

Efter inkubation, plade 200 mikroliter af bakteriekulturen på en 10 centimeter LB agar plade, der indeholder udvælgelsen antibiotika valg. Kultur bakterierne på LB agar plade i bakterier inkubator ved 37 grader celsius natten over. Efter en vellykket kolonidannelse skal du vælge en enkelt koloni og sprede den i fem milliliter NZCYM med de valgte antibiotika.

Kultur i bakterieinkubatoren ved 37 grader celsius natten over. Efter vellykket bakterievækst forstærkes bakterierne i 250 milliliter, 500 milliliter eller en liter partier af medium afhængigt af efterspørgslen efter proteinmængde. Derefter kultur bakterierne, i bakterier inkubatoren ved 37 grader celsius i to til tre timer.

Efter inkubation udtages en prøve til fotometrisk analyse. Hvis den optiske massen ved 600 nanometer har nået 0,4, anvende 200 mikromolar op til en millimolar isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid. Efter tre til fem timer mere i bakterieinkubatoren ved 37 grader celsius proteinudtryk er opbrugt.

Høst den bakterielle pellet via centrifugering på 5,000 gange G i fem minutter. Derefter kasseres supernatant og fryse pellet ved minus 20 grader celsius for kort opbevaring. For hver 250 milliliter original bakteriel suspension, anvende fem milliliter af den valgte buffer til bakteriel pellet.

Der tilsættes 10 mikroliter beta-mercaptoethanol pr. 5 ml påført buffer. Brug en 10 milliliter Pasteur pipet til mekanisk at tvinge pellet i suspension ved ridser og pipettering. Hele suspensionen overføres til et 50 milliliterrør.

Derefter sonikere suspensionen. Dernæst centrifuge i 30 minutter ved høj hastighed ved fire grader celsius. Supernatanten filtreres fortløbende med filterenheder på is.

Forbered en tom plast eller glas søjle ved at fastgøre den til en stabil holder og vask med nikkel NTA kører buffer. For hver 10 milliliter proteinsuspension påføres 500 mikroliter nikkel NTA agarose gylle på kolonnen. Fyld kolonnen helt med nikkel NTA løbebuffer, der sikrer, at agarose harpiksen ikke forstyrres, og lade bufferen løbe igennem af tyngdekraften.

Derefter påføres proteinsuspensionen på kolonnen, og lad prøven løbe igennem af tyngdekraften. Når prøven er passeret igennem, fyldes kolonnen med nikkel-NTA-løbebufferen. Placer en UV gennemsigtig kuvette under kolonnen og indsamle en milliliter nikkel NTA elution buffer.

Prøvens optiske massetæthed kontrolleres ved 280 nanometer i forhold til en blindprøve. Optimalt viser prøven en optisk tæthed på over 2,5. Da FAHD-proteiner og nikkel NTA-elutionbufferen vil udløse ved frysning og optøning, dialyserer proteinet mod en anden buffer natten over på is ved hjælp af en mikroliter DTT pr. 100 milliliter dialysebuffer.

Opret et FPLC-system, og vask kolonnen med fem kolonnemængder på 20 % ethanol efterfulgt af fem kolonnemængder vand. Efter at kolonnen er ligevægt, påføres den dialyserede prøve på kolonnen, og strømmen opsamles. Konfigurer en graduerings-elution.

Når forløbet er færdigt, køres med høj saltbuffer, indtil der ikke registreres flere toppe over området med én kolonnevolumen. Start en mikropladelæser og ligevægt i 30 minutter ved 25 grader celsius. Der klargør en milliliter en 20 millimolaropløsning af et substrat, der skal testes i enzymanalysebufferen.

Ifølge pipetteringsordningen i tekstprotokollen skal enzymblyten og prøveblydene tilberedes med 90 mikroliter enzymanalysebuffer i brøndene med fem mikroliter enzymopløsning. Derefter forberede substrat blank og prøve brønde ved pipettering 95 mikroliter af enzym assay buffer i brøndene. Lige før måling, anvende fem mikroliter af enzym assay buffer til de seks tomme brønde.

Der påføres fem mikroliter af 20 millimolar substrateopløsningen på prøvebondene. Brug en multi-kanal pipet ved 50 mikroliter indstilling til forsigtigt at blande brønde. Sæt derefter pladen ind i mikropladelæseren og mål hver brønd ved 255 nanometer.

Endelig udføre analysen i et regneark. To eksempler LB agar plader efter optimal og ikke-optimal transformation er afbildet her. Alt for mange bakteriekolonier indikerer enten, at to mange bakterier var belagt, eller at antibiotika kan være udløbet.

For få bakteriekolonier kan indikere, at enten ikke nok plasmid blev brugt til transformationen, eller at for meget antibiotika blev brugt til at vælge bakterierne. Den bakterielle pellet, der indeholder det udtrykte protein i milligram mængder er høstet og udtryk er verificeret via SDS-side. Nogle problemer kan opstå under denne ellers enkle proces, herunder de proteiner, der danner inklusionsorganer, eller proteinet, der ikke udtrykkes.

Hvis en His-tag bruges til at mærke protein, affinitetkromatografi med nikkel NTA agarose er en nem og billig fangst metode fjerne de fleste forureninger. Hvis der ikke anvendes et mærke, kan en kombination af ammoniumsulfatuddældning og en sammenhængende hydrofobisk udvekslingskromatografi også adskille proteinet fra de fleste andre proteiner. Proteinet er yderligere adskilt fra sidesten forureninger med ionbytterkromatografi efterfulgt af størrelse udelukkelse kromatografi for at opnå et tilstrækkeligt rent protein.

Ingen af de beskrevne metoder er især vanskelige. Men alle metoder kræver uddannelse. Første forsøg kan mislykkes, men forsøgene vil lykkes efter nogle yderligere tilpasninger.

Alle metoder, der præsenteres her, er generelle metoder til proteinrensning. Selv om specialiseret til FAHD proteiner, protokollen kan tilpasses til ethvert protein, man gerne vil rense. Rekombinant menneskelige FAHD-1 er opnået ved de beskrevne metoder og høj opløsning x-ray strukturer bidraget massivt til vores forståelse af FAHD-1 ved funktionalitet fungerer som både, decarboxylase og hydrolase.

Bakterier, der anvendes i dette arbejde er sikkerhedsstammer og ikke farlige. Generelle sikkerhedsvejledninger gælder for alle kemikalier, og FPLC-kolonner skal håndteres med forsigtighed.