Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Evaluering av protein-protein interaksjoner ved hjelp av en on-membran fordøyelsen Technique
Chapters
Summary July 19th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenterer vi en protokoll for en on-membran fordøyelsen teknikk for utarbeidelse av prøver for masse massespektrometri. Denne teknikken forenkler praktisk analyse av protein-protein interaksjoner.
Transcript
Forskning på protein-protein interaksjon er uunnværlig for å forstå fysiologiske prosesser i flere felt. I denne videoen introduserer vi fordøyelsesteknikk på membranen som gjør det mulig for forskerne å utføre en omfattende analyse av bindende proteiner ved MS på en praktisk måte. Den største fordelen med denne teknikken er at vi kan forbedre gjennomstrømningen av proteomisk analyse for rå immunprecipitants fordi separasjon av proteiner ved polyakrylamid gel elektroforese er ikke nødvendig.
Begynn å konjugere antistoffet til de magnetiske perlene, ved å blande anti-GFP-antistoffet med perlene i 500 mikroliter citratfosfatbuffer. Roter blandingen ved 50 O/min i én time ved romtemperatur. Og vask deretter de konjugerte perlene tre ganger med citratfosfatbuffer som inneholder 1% polysorbat 20.
Lyse transfected celler i henhold til manuskript retninger. Skrap parabolen og overfør lysatet til det 1,5 milliliters testrøret. Fjern deretter lysate ved sentrifuging på 15.000 x g i fem minutter og samle supernatant.
Forbered umerkede magnetiske perler ved å vaske dem tre ganger med 500 mikroliter citratfosfatbuffer. Etter den endelige vasken, fjern bufferen og legg til cellelylat til perlene. Roter blandingen ved 50 o/min i 30 minutter ved romtemperatur.
Utfør magnetisk separasjon på magnetstativet og samle cellelylat. For å binde målproteinene til immunoglobulinkonjugerte perler, legg perlene på magnetstativet i fem minutter. Kast citratbufferen og legg til cellelylat til perlene.
Roter blandingen i en time ved 50 o/min. For å skille målproteiner fra de frie ikke-målrettede proteinene, vask perlene tre ganger med 500 mikroliter citratfosfatbuffer som inneholder 1% polysorbat 20. Etter den endelige vasken legger du til 30 mikroliter citratbuffer, og la perlene sitte i fem minutter ved romtemperatur for å elute målproteinene.
For å forberede membranen, kutt PVDF membraner i 3 millimeter med 3 millimeter stykker ved hjelp av kirurgisk saks som ble rengjort umiddelbart før bruk. Plasser membranen på aluminiumsfolie og legg til to til fem mikroliter etanol til hvert stykke. Før membranene er helt tørre, tilsett to til fem mikroliter av proteinet eluent til hvert stykke og lufttørk dem til membranoverflaten blir matt.
Overfør deretter membraner til 1,5 milliliter rør og lagre dem ved fire grader Celsius. Hvis du bruker umiddelbart, legg til to til 30 mikroliter etanol som vil gjøre dem hydrofile. Fjern etanol med en pipette, men før membranene tørker, tilsett helt 200 mikroliter DTT-basert reaksjonsløsning til hvert rør, og inkuber dem ved 56 grader Celsius i en time.
Etter inkubasjon, erstatt reaksjonsløsningen med 300 mikroliter iodoacetamidoppløsning, og inkuber i mørket i 45 minutter. Vask deretter membranene to ganger med destillert vann og en gang med 2% acetonitril ved å virvle i minst ti sekunder. Arbeid med diaphanous-relatert acetonitril kan være ekstremt farlig.
En maske, briller og hansker bør alltid brukes når du utfører fordøyelsesprosedyren på membranen. Forbered trypsin i henhold til manuskriptretninger, og legg til 100 mikroliter trypsinreaksjonsløsning til hver membran. Inkuber over natten ved 37 grader Celsius for fordøyelsen.
Neste dag, overfør reaksjonsløsningen til et rent 1,5 milliliter rør, og tilsett 100 mikroliter vaskeløsninger til membranen. Inkuber membranen ved 60 grader Celsius i to timer, og samle deretter vaskeoppløsningen og bland den med reaksjonsløsningen. Tilsett ytterligere 100 mikroliter vaskeoppløsning til membranen og soniker den i 10 minutter.
Deretter samler vaskeoppløsningen og blander den med reaksjonsløsningen. Dekk røret med et stykke laboratoriefilm og lag små hull i filmen med en nål. Tørk løsningen ved hjelp av en vakuumkonsentrator, og oppløs rester i 10 mikroliter på 2% maursyre.
Sentrifuger røret ved 12 000 x g i tre minutter, og overfør supernatanten til et prøverør. Analyser prøven ved hjelp av et massespektrometer knyttet til et nanoLC/HPLC-system. Ved hjelp av denne protokollen ble 17 proteiner identifisert i Calpain-6 assosiert immunprecipitant, 15 i GFP-assosiert immunprecipitant, og 11 ble identifisert i begge.
Det er viktig å merke seg at påvisning av minst ett høy kvalitet peptid fragment er nødvendig for positiv identifisering av en kandidat protein. Proteiner som utløste i GFP-uttrykkende lysat samt histoner, eksogene og ribosomale proteiner ble utelatt fra listen. Vasking av membranene før tryptisk fordøyelse med destillert vann og 2% acetonitril er det viktigste trinnet i prosedyren for fordøyelse på membranen over proteiner.
Etter denne metoden er det mulig å bekrefte samtidig utfelling av målprotein ved å gjennomføre andre eksperimenter, som immunforeledning og vestlig flekkanalyse. Denne enkle metoden gjør det mulig for forskerne å utforske de nye protein-proteininteraksjonene med praktisk og høysensitiv analyse.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
